肠道病毒检测及其抗病毒药物研究进展_赵晓光.

1、*基金项目 :辽宁省博士科研基金 （20052135 作者单位:1 辽宁省疾病预防控制中心微生物所 ,沈阳 110005; 2 解放军疾病预防控制所 ; 3 军事医学科学院卫生学环境医学研究所 作者简介:赵晓光（1954-,女,黑龙江哈尔滨人 ,副主任技师 ,中 专,主要从事肠道病毒及呼吸道病毒研究。 文章编号:1001 0580（200703 0375 03中图分类号 :R 181 3 文献标志码 :A 综述 肠道病毒检测及其抗病毒药物研究进展 * 赵晓光 1 ,郭金鹏 2,3 ,谌志强 3,李君文 3,李援 1,赵虹 1,郑洪 1,郭军巧 1 肠道病毒（EV可引发多种感染，并且发病又多以综

2、合征出现，病情轻重悬殊，婴幼 儿患者可暴发严重心肌炎或重症肺炎 ,尤其新生儿期的暴发流行可致死亡。一种综 合征可由不同病毒所引起 ,同一种 （型病毒可以导致不同综合征是肠道病毒属病毒感 染的普遍现象。患者感染肠道病毒后多数为亚临床表现,不易被发现 ,因此,有效而及 时地作出病原学诊断难度较大。目前除脊髓灰质炎外,尚无疫苗可供预防 ,是当前严 重影响人类健康的重要病原之一。因此 ,建立快速、简便、特异的病原学诊断方法 , 研制广谱的抗病毒药物是今后的研究热点。现将近年来国内外有关检测技术和抗病 毒药物研究进展综述如下。 1 肠道病毒检测 1 1 病毒分离培养 利用组织培养技术从感染部位或传染源分

3、离出病毒并鉴定其 特异性血清型是病毒性疾病诊断的金标准。病人粪便标本是最常采集的标本,其他 如咽拭子、脑膜炎患者的脑脊液、心包炎患者的心包积液、手足病患者的疱内渗出 液、结膜炎患者的眼部分泌物等都是常用分离病原的标本。分离时所选用的细胞系 都系人源或猴源的细胞 ,它们都具有肠道病毒受体 ,对所要分离的病毒敏感。常用的 有Hep -2、Hela、巨核细胞（M K和一些猴源的传代细胞如 Vero等,肠道病毒能在 敏感细胞中增殖并致细胞产生病变。病毒培养对缩短抗生素治疗和住院期有积极作 用,其定型诊断对流行病分析有重要意义 ,但是,病毒的分离鉴定繁琐、费力、耗时 , 般需要 1周才能观察到细胞病理反

4、应 ,且费用高、敏感性低 ,并需要较高的专业知识 及实验室设备 ,更重要的是许多肠道病毒不能进行细胞培养 ,或者可以培养但不出现 细胞病理效应 ,如柯萨奇 A 组病毒,往往贻误特异性治疗 ,同时对诊断某些肠道病毒血 清型和脑膜炎的敏感性也欠佳 ,给临床诊断和快速检测工作带来困难和挑战 1 。 1 2 血清学鉴定 分离病毒和利用组合血清中和试验是对病毒定型的重要方法。 肠道病毒的血清学鉴定中 ,一般单份血清抗体效价无意义 ,因为健康人血清中都有一 定效价;而取双份血清检测 ,恢复期抗体效价呈 4倍以上升高 ,有诊断意义 ,因此,多选 用组合血清。此方法在检测中不适用于早期诊断 ,可作为回顾性诊断

5、 ;且由于肠道病 毒血清型别众多 ,临床使用检测价值有限 ,而多为流行病学采用 1 。利用酶联免疫吸 附试验（EL ISA捕捉法或间接法检测早期病人血清中的IgM和I gG抗体,是较常用 的检测指标 ,尤其以柯萨奇 B 组病毒的感染诊断较多 ,病毒抗原可从心、脑、脾、 胰、肝和胸腺等多器官检出。 1 3 PCR 技术 由于各型肠道病毒具有共同基因组序列 , 因而 P CR 技术问世后即被用于检测肠道病毒。 PCR 可检出几乎所有血清型。 PCR 检测材料用量少、快速、灵敏度高且具特异性 ,并可通过设计不同的引物进行 病毒分型 ,用于检测相当宽的肠道病毒血清型。 EV -P CR 一般可在收到标

6、本后 524h内提供诊断结果，是目前较理想的诊断技术2-5。EV-PCR比传统细胞培养法 的检出率高。原因是不论病毒活性在标本处理过程中是否失活 ,或病毒增殖过程中 形成的缺陷性病毒能否感染细胞而影响培养结果 ,其核酸相对稳定仍能被检出。 Saw yter等2、Rotbart 3等、Hamiltion 4等和M uir 5等分别报道PCR从脑脊液、血、 尿、粪、咽拭标本中检出肠道病毒 ,其灵敏度达 88%100%,特异性为 83%97%。与 细胞培养法比较 ,PCR 检出率明显提高 ,估计敏感性增强 101000倍。在临床检测方 面,M anzar a 6等用免疫学和分子生物学综合方法,从临床

7、标本中检测肠道病毒，并予 以定型。 Craig 7 等将酶联免疫吸附试验 (EL ISA 方法与 PCR 比较,证实了二者的互 补性。 Billaud 8 等建立的 PCR 方法可同时检测并区别上呼吸道标本中人轮状病毒 和肠道病毒 ,拓宽了 PCR 的应用。在公共卫生监测方面 ,Gantzer 9 等用 PCR 对废水 中的肠道病毒进行检测 ,废水经过玻璃粉或玻璃棉处理 ,吸附、浓缩后用 RT -PCR 技 术使肠道病毒检出率大大提高。 K ellogg 10 等人建立的 RT -P CR-DN A 酶免疫法 (RT -PCR-DEIA,可进一步缩短检测时间，其特点是用一种对热稳定的rT h聚

8、合酶代 替转录酶和T aq聚合酶，用地高辛-dUT P标记终产物，然后用微孔杂交法验证，所需 时间不到 4h 。 Jean 11等发展了基于核酸序列扩增的酶联免疫吸附法 (NASBA-EL ISA ,其为一种恒温的 RNA 扩增技术,整个扩增过程在 40 下进行,标准的反应体系包 括禽类成骨髓细胞瘤毒 (AM V 逆转录酶、 T 7RNA 合成酶、 Rnase -H、 dN T P 、 N T P 、 2个特殊的引物和适宜的缓冲液 ,然后用酶联免疫法对扩增产物进行证实 ,其优 点在于直接对 RN A 扩增,不需要热循环仪,无需特殊的仪器 ,已成功应用于水果、蔬 菜中甲型肝炎病毒 (HA V 的

9、检测。 近年出现的荧光实时定量 PCR 应用与靶序列直接结合的荧光探针可将生成的 RNA加以定量，其特点为检测快速(从样品准备到数据分析只有3h、敏感性强、扩 增产物可直接定量、密闭系统防止交叉污染等 ,这些优点奠定了其在肠道病毒检测 中的广阔应用空间。 Nijhuis 12 等利用肠道病毒属基因组 5 端的高度保守序列设计 引物，能够检测出肠道病毒属的所有血清型，并且与RNA科其他属(肝炎病毒属、副 埃可病毒属病毒无交叉反应 ,对来自临床的样本如血清、血浆、鼻咽拭物、脑积液 等检测结果显示 ,其灵敏度与病毒的组织培养相当 ,甚至更好。使用 T aqM an PCR 具有自动化、易标准化的特点

10、 ,使其可能成为病毒检测中组织培养的替代方法。 2 抗 肠道病毒药物 2 1 普拉康纳利 普拉康纳利 （Pleconaril 1 3 为近年来首先试用于临床的、仍在研究的可抑制肠道病毒复制的药物。该 药口服吸收良好 ,具有广谱抗微小核糖核酸病毒活性 ,其主要通过与病毒的蛋白 衣壳结合而干扰病毒对宿主细胞的吸附和脱壳13 ,能对 90%以上的肠道病毒血清型 起作用 14 。该药在鼻分泌物及中枢神经系统中的浓度比血清浓度高数倍,因而更适 用于肠道病毒呼吸系统感染或中枢神经系统感染的治疗。普拉康纳利已经被应用于 肠道病毒呼吸系统感染、中枢神经系统感染、危及生命的新生儿肠道病毒感染及免 疫缺陷者的慢性

11、肠道病毒感染等疾病中 ,临床显示有减轻症状、缩短病程等效果 ,不 良反应轻微 ,主要为恶心及腹痛 ,多可以耐受。该药是一种有应用前景的候选药 ,对其 进一步的研究将有助于肠道病毒感染的特异性治疗。 2 2 蛋白酶抑制剂 肠道病毒所属微小核糖核酸病毒属 （Picornavirus 病毒的侵染 细胞后 ,其基因组首先转录成 1个前体蛋白多聚体 ,而该多聚体需要在病毒 3C 蛋白 酶的裂解作用下才能产生其他结构蛋白和蛋白酶 ,完成整个生命周期。 3C 蛋白酶是 Picornavirus 病毒属病毒复制所必需的特异性蛋白酶之一 ,同时对其基因组研究发现 , 编码3C蛋白酶的基因序列高度保守，因此,3C

12、蛋白酶就成为抗小RN A病毒药物开 发的重要靶标15。目前依据3C蛋白结构设计出的抗病毒物质有多种，其中A G7088是最有希望成为临床药物的物质之一。AG7088为抗人轮状病毒而设计，在所 试验的48个血清中均有抑制效果。在细胞培养水平检测A G7088抗病毒谱的结果 显示，对埃可病毒（EV11、肠病毒（ET V70、柯萨奇病毒（CVA21、CV B3、巨细胞病 毒（HCM V AD169、单纯疱疹病毒（HSV-1均有直接抑制作用，半数致死浓度（EC50 和90%致死浓度（EC90分别为0 0030 081 mol/L和0 018 0 261 mol/L,而其毒性浓 度为1000 mol/L

13、,治疗系数为12346333333之间。在作用时间效果实验中,AG7088 在感染后6h用药仍然具有良好的抗病毒效果 16。因此，以病毒颗粒结构为基础设 计的抗病毒物质普拉康纳利和 A G7088及其衍生物是目前最有希望的治疗小 R NA 引发疾病的临床药物。 2 3 抗病毒中药 抗肠道病毒植物药的筛选为寻找开发新的抗病毒中药制剂开辟 了广阔的前景。中医药和民族民间医药作为我国的传统医药 ,对有关病毒引起的疾 病及其防治积累了丰富的经验 ,从中发掘新的抗病毒有效物质和天然药物方面有着 广阔的前景。我国科研人员利用组织培养筛选抗病毒中草药已几十年的历史,已经 筛选出近百种 ,其中用于抗肠道病毒的

14、天然植物药物有苦参、黄芪、大黄、水飞 蓟、金银花、虎杖、空心莲子草、贯众、山豆根、败酱草、高山红景天、大蒜素、 人参皂苷和薄荷醇提取物等 ,这些均被证明在体外或具有灭活病毒、或能抑制病毒 增殖,有保护培养细胞的作用 17,18 。目前用于抗肠道病毒药物的筛选模型主要是体 外细胞培养模型 ,通过观测经病毒和药物处理后的细胞存活状况、病毒的存活数量, 以此反映药物的作用效果。观测指标主要有细胞病变(CP E、利用噻唑蓝或中性红 等染料摄入法检测细胞存活率、RT-PCR检测病毒RNA等。国内研究较深入的为 苦参、大黄、贯众、高山红景天多糖等。研究表明 ,苦参总碱可以进入细胞内发挥 抗病毒作用 ,能够

15、抑制病毒蛋白的合成 ,从而可阻断病毒的复制过程 ,达到治疗效果。 同时苦参总碱还能在小鼠体内证明有抑制病毒血症 ,抑制病毒在心肌中增殖及抑制 心肌炎症发展的作用 19 。孙非 20 等对高山红景天多糖的研究发现 ,该多糖能明显 的抑制体外培养心肌细胞在受到柯萨奇 B3 病毒感染后导致的心肌酶释放 ;显著降低 病毒在心肌细胞中的增殖量；其半数有效抑制浓度为150mg/L;有效浓度平均抑制率 为71 3%,表明高山红景天多糖对在 SD大鼠心肌细胞内增殖的柯萨奇 B3病毒具有 一定的抑制作用。目前对于中草药抗病毒的研究多集中在粗提物的初步研究 ,对机 制的研究仅仅是从病毒侵染的时间来推断活性成分的可

16、能作用 ,无法提供确切的作 用机制也制约了中药产品走向国际市场的步伐。 3 展望 虽然肠道病毒感染后通常无症状而被忽略 ,但其普遍分布于世界各地 ,感染广泛 存在,并且常引起暴发 ,导致数量比平常更多的病人发展成为临床病例 ,甚至死亡。因 此，对肠道病毒的监测、检测和药物治疗应该给以足够重视。 PCR等检测技术的发 展使得从血清、心肌细胞、粪便、脑脊液、环境水中均能检测出肠道病毒基因组 , 为其诊断提供证据 ;同时 ,也为研究肠道病毒与疾病的关系提供大量科学数据。对于 肠道病毒的治疗目前主要以对症治疗为主 ,国外在研制化学合成药物方面保持领先 的同时 ,正在抓紧时间占领国际天然药物市场。我国的

17、天然资源丰富 ,已经查明的植 物品种数量占世界的第 3 位,加上数千年的中医中药和民间医药的宝贵经验 ,我国具 有开发和利用天然药物的独特优势 ,也将成为开发防治肠道病毒感染药物的重要来 源。 参考文献 1 Stefania M,M ichele M,Giuseppina L R,et al.M olecular identifi cation and typing of enteroviruses isolated from clinical specimens J.J Cli n M icrobiol,2002,40(12:4554-4560. 2 Saw yer MH,Holland D

18、,Aintablian N,et al.Diagnosis of enterovi ral central nervous system infection by polym erase chain reaction duri ng a large commun i ty outbreakJ.Pedi atr In fect Dis J,1994, 13:177-182. 3 Rothart HA,Ahmed A,Hickey S,et al.Di agnosis of enterovirus infecti on by polymerase chain reacti on of multip

19、le specimen types J.Pediatr Infect Dis J,1997,16:409-411. 4 H amilton M S.Jackson M A,Abel D,et al.Clinical utility of poly merase chain reaction testi ng for enteroviral meningitisJ.Pediatr Infect Di s J,1999,18:533-537. 5 M uir P,Ras A,Klapper PE,et al.Clinical utility of polymeras e chai n reacti

20、on testing for enteroviral meningi tisJ.J Clin M icro bi ol,1999,37(5:1409-1414. 6 M anzara S,M uscil lo M,La Rosa G,et al.M olecular identification and typing of enteroviruses isol ated from clinical specimensJ.J Clin M icrobiol,2002,40:4554-4560. 7 Craig M E,Robertson P,How ard NJ,et al.Diagnosi s

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24、assay in sewage treatment effluentJ.FEM S M icrobiol Lett,2002,210:143- 147. 12 Nijhuis M,M aarseveen N,S chuurman R,et al.Rapid and sensitive routine detection of all members of th e genus enterovirus in differ ent cli n i cal specimens by Real-T i m e PCRJ .J Clin M icrobiol, 2002,40(10:3666-3670.

25、 13 Naomi RF,Dana M ,David P,et al,Pleconari l,anovel anti picor naviral agentJ.Pharmacoth erapy,2003,23(3:339-348. 14 袁艺,宋国维.肠道病毒呼吸道感染的诊断治疗进展 J .国外 医学 :儿科学分册 ,2005,32(5281-284. 15 M athews DA,Dragovich PS,W ebber SA,et al.S tructure-assi st ed design of mechani sm -based irreversible inhibi tors of

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27、 Agents Chemother,1999,43:2444-2450. 17何宽其 .中草药抗柯萨奇 病毒实验研究进展J中国中医药信息杂志，2003,10(986-87. 18姚莹.中药抗柯萨奇B3病毒的实验研究进展J .西北药学杂 志 ,2005,20(4:190-192. 19 陈曙霞,彭旭,刘晶星,等.苦参对感染柯萨奇 B3 病毒乳鼠搏动心肌细胞的保护作 用J.中华实验和临床病毒学杂志，2000,14(2:137-140. 20 孙非,肖纫霞 ,孙寒.高山红景天酪醇对病毒性心肌炎小鼠免疫功能及抗氧化酶活 性的影响 J .中国药理学通报 ,2000,16(1:120. 收稿日期:2006

28、 06 15 (文涛编辑 宋艳萍校对 文章编号: 1 001 0580(200703 0377 01中图分类号 :R 195 文献标志码 :B 基层公共卫生 阜新市城区居民伤害死亡分析 田晓东 伤害正在逐渐成为现代社会威胁人类健康的主要原因之一 1 。近年来 ,伴随着 城市现代化进程的加快 ,机动车剧增、工作压力加大、竞争激烈 ,人为灾难多发 ,各种 伤害也在不断增加 2 为了解阜新市城区居民近年来伤害死亡情况 ,为开展伤害的预防与控制提供 依据 ,本文分析了 20012005年阜新市城区居民伤害死亡登记资料。结果报告如 下。资料与方法 (1资料来源 :死亡资料来自阜新市 20012005年城

29、区居民病伤死亡 原因卫生统计年报表，按ICD-10标准进行分类;人口资料来自阜新市公安局提供的 人口数据。 (2分析方法 :采用死亡率、标化死亡率、死亡构成、死因顺位、性别及 年龄别死亡率及构成比等作为分析指标 3 。采用1 990年全国人口普查标准人口对数据进行标化。结 果 (1伤害死亡变化 趋势:20012005年阜新市城区共死亡 1 7400人,其中伤害死亡 1 1 01人,占总死亡构成 的 6 33%,且死亡率水平呈缓慢下降趋势。 2005 年我市曾发 生重大安全生产事故 (矿难,实际死亡率为 65 62/10万,去 除矿难因素,死亡率为 38 28/ 1 0万。 (2死因别伤害死亡水

30、平及分布特征 :5年中, 伤害死亡总死亡率为 37 84/10万,其 中男性为 53 96/1 0万,女性为 21 97/ 1 0万,男性高于女性 ,男女性别比为 2 46:1。 男性伤害死亡的前 3 位死因分别为机动车交通事故、非机动车交通事故和自杀,其 死亡率依次为 13 23/10万,7 48/1 0万和6 93/ 1 0万,占伤害构成的 51 22%;女性伤害死亡的前 3 位死因与男性相同 ,但死亡率 明显低于男性 ,其死亡率依次为 5 39/10万,4 98/1 0万和 2 80/10万,占伤害构成的 59 93%。(3 年龄别伤害死亡水 平及分布特征 (表 1 :0岁组伤害死亡以机动车交通事故占首位 ,1019岁以自杀 占首位 ,2039岁以被杀占首位。在机 动车交通事故中 ,30岁年龄组为高危人群 ,自杀以 3049岁为高危人群,被杀则以 3039岁为高危人群。表 1 20012005年阜新市城区居民伤害死亡前 5位死因年龄 别死亡比较 年龄（岁 机动车交通事故 死亡数(例死亡率 (1/10万构成比 (% 自杀 死亡数(例死亡率 (1/10万构成比 (%非机动车交通事故死亡数 (例死亡率 (1/10万 构成