DNA提取实验报告

1、大肠杆菌和植物基因组 DNA 提取生科基 彭健鹏 20121412420481. 大肠杆菌DNA提取方案设计实验目的学习并掌握细菌基因组的提取方法提取大肠杆菌DHa中的DNA并进行质量检测实验概述提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠( SDS和 蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得 到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。试验准备实验材料：大肠杆菌 DH5a 菌液实验试剂：LB液体培养基，TE溶液，10%SDS蛋白酶 K, 5mol/L NaCl , CTAB/NaCI溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%L醇实验仪器与用具：微量移

2、液器，低温离心机，水浴锅， eppendorf 管，恒温 摇床 实验步骤(1) 将2mL培养至对数期的大肠杆菌 DH5x菌液5000rpm冷冻离心10分钟 弃上清；目的：分离大肠杆菌与其培养液。(2) 力卩190卩L TE悬浮沉淀，并力卩10卩L 10%SDS1y L 20mg/mLg白酶K, 混匀，37C保温1h;目的：裂解大肠杆菌。(3) 加 30 卩 L 5mol/L NaCl，混匀；目的：盐析。NaCl降低DNA在水中的溶解度且不破坏其结构,从而提取粗的 DNA在浓氯化钠(1-2M)溶液中，DNP的溶解度很大，RNP的溶解度很小； 在稀氯化钠(0.14M)溶液中，DNP的溶解度很小，R

3、NP的溶解度很大； 0.14MNaCI-0.01MEDTA溶解 RNP 而使 DNP沉淀。(4) 力卩30卩L CTAB/NaCl溶液，混匀，65C保温20min；目的：CTAB十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与 核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7 mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐浓 度到一定程度(0.3 mol/L NaCl )时，从溶液中沉淀。通过离心就可将 CTAB核 酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA而CTAB 溶于乙醇或异丙醇而除去。(5) 加入300卩L酚/氯仿/异戊醇(25: 24: 1)抽提，5000rpm离心1

4、0min, 将上清液移至干净离心管；目的：分离蛋白多糖和DNA得到较纯的DNA若此步得到DNA不纯，可重 复此步骤进行多次纯化。(6) 加300卩L异丙醇，颠倒混合，室温下静止10min,沉淀DNA 5000rpm 离心10min,沉淀DNA加入500卩L70聽醇，5000rpm离心10min,弃乙醇，吸 干；目的：将DNA沉淀出，进一步用乙醇促进 DNA析出水。(7) 取少量用光谱仪测DNA质量，并取少量跑电泳。 目的：对DNA屯度的检测。注意事项DNA浓度和纯度的测定方法从提取的DNA样品中取出1卩L,用TE稀释到100卩L,用紫外/可见分光光 度计，分别测定260 nm和280 nm的吸

5、光值OD26C和OD280计算检测DNA勺纯 度、浓度和产率。(1) DNA 纯度=OD260/OD280DNA勺纯制品的 OD260/OD28值为1.8，而RNA的纯制品的OD260/OD28值 为2.0。若OD260/OD28值高于1.8，那么说样品中可能有 RNA的污染；若样品 中蛋白或酚的污染较严重则 OD260/OD28值低于1.8。(2) DNA浓度(ng/ 卩 L)= OD26(X 50 卩 g/mLX 100 倍(1 OD260=50ng/卩 l )(3) DNA产率(ng/g FV)= OD26(X 50 卩 g/mLX 100 倍 x 50 卩 L/0.5 g (体 积/取

6、材量)2. 植物基因组DNA提取实验目的 ：a) 了解真核生物基因组DNA提取的一般原理；b) 掌握植物基因组DNA提取的方法和步骤。实验原理 ：c) 使用液氮对植物叶片进行研磨，在保证破碎细胞的同时，会大大降低酶 活，减少DNase对植物基因组DNA的降解作用。d) 植物提取液中含有SDS可溶解蛋白，使之变性从而脱离基因组 DNAe) 提取液中EDTA同样可通过螯合金属离子从而使 DNase丧失活性，保护植 物基因组DNA不被降解。实验材料 ：f) 液氮。g) 细胞提取液： 100mmol/L Tris-HCl pH8.0，5mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl， 1.25%

7、 SDS 1%3 -巯基乙醇。h) 5mol/L KACi) 饱和酚j) 氯仿/异戊醇( 24： 1)k) 异丙醇l) 70%乙醇m) ddH2O实验步骤 ：n）取500卩L细胞提取液于65C水浴中加热。o）研钵用液氮预冷，新鲜植物叶片（自来水清洗，蒸馏水冲洗干净），去除 主体叶脉，剪成细条状，置于研钵中混合液氮进行研磨，将其研磨成粉 末状。注：保证在研磨过程中DNase不会对植物基因组DNA4行降解，同时由 于液氮的存在，植物叶片变得松脆，极易研磨至粉末状。p）取0.1g粉末（约1药匙）转移至500卩L预热的细胞提取液中，轻柔摇 匀，65r水浴中保温20min, 5min左右温和颠倒混匀一次

8、。注：自研磨结束起，植物基因组DNA变暴露在体系中，应动作尽量轻柔， 防止机械剪切力对植物基因组DNA造成破坏，影响植物基因组DNA完整 性。q）从水浴中取出Ep管，加入150卩LKAC溶液，颠倒混匀，冰上放置20min 后离心（10000rpmx 10min）。注：KAC可使SDS变成水不溶性PDS从而通过沉淀PDS4步沉淀蛋白 质。r）将上清液转移到另一干净Ep管中，加等体积酚（约250卩L）、氯仿/异 戊醇（约250卩L），温和颠倒混匀，离心12000rpmx5min,取上清液于 另一干净Ep管中。s）加等体积氯仿/异戊醇（约470卩L），温和颠倒混匀，12000r/min x 5min

9、, 取上清液到另一干净Ep管中。t）加入等体积的异丙醇（沉淀 DNA，温和颠倒混匀，-20 C沉淀1h。u）离心12000rpmx 3min后，去上清，获得沉淀，加入 1000卩L70汇醇离 心 12000r/min x 2min。v）自然干燥至无乙醇气味后，加入 20卩LddHO,溶解DNAw）取5卩L溶液，0.7%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。实验结果与讨论4225细菌的分光光度计的峰值及 DNA含量的测量结果A?SO*聲拦n2* AA30teva 咖12061 ?44awe呦训_植物0D值及含量测定结果植物的电泳结果，1为15k的Marker，2 为 5k 的 Marker最左边为15

10、K的Marker的条带,B1和B2明显都有一个条带超过 了 Marker的测量范围。从分光光度计的结果来看大肠杆菌组实验中 DNA提取是较为成功的，因为其 A260/A280的数值是基本符合预期结果的，基本在1.8到2.0之间而且A260/A230 的值也说明DNA提取中基本除掉了糖和盐的干扰。从电泳结果上来看，大肠杆菌组实验可以观察非常明显的一个超出了marker范围的条带，而这个条带就是我们通常认为的组 DNAo植物组实验虽然也可以看 到一条较为明显的超过 marker的条带，但是在电泳结果中出现大片模糊的情况， 这就说明在提取植物DNA的过程中存在问题只是DNA的提取出现了污染。感想与心得本次试验中最大的感想来自于实验结果的记录。就此以上的结果记