X312基因工程的基本操作程序课件

1、X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1 1 专题专题1 1 基因工程基因工程 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2 2 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序3 3 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序4 4 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序5 5 外显子外显子内含子内含子 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序6 6 结构基因结构基因 外显子外显子 内含子内含子 转录、加工修饰转录、加工修饰 成熟成熟mRNA X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序7 7 X312基因工程的基本操作

2、程序基因工程的基本操作程序8 8 从基因文库中提取目的基因从基因文库中提取目的基因 1 1 基因文库基因文库(gene library)(gene library)概念概念 n又称又称DNADNA文库，是指某个生物的基因组文库，是指某个生物的基因组DNADNA 或或cDNAcDNA片段与适当的载体在体外重组后，片段与适当的载体在体外重组后， 转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛 选后得到大量的阳性菌落选后得到大量的阳性菌落( (或噬菌体或噬菌体) )，所，所 有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因 文库。文库。 n基因文库由

3、外源基因文库由外源DNADNA片段、载体和宿主组成。片段、载体和宿主组成。 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序9 9 基因文库的分类基因文库的分类 按照外源按照外源DNADNA片段的来源：片段的来源： u从特定组织提取的染色体基因组从特定组织提取的染色体基因组DNADNA - -基因组基因组DNADNA文库文库（总）（总） umRNAmRNA反转录成的反转录成的cDNAcDNA拷贝拷贝-cDNAcDNA文库文库（部分）（部分） 基因文库的目的基因文库的目的 为了在不知目的基因序列的情况为了在不知目的基因序列的情况 下，便于获得所需的目的基因。下，便于获得所需的目的基因。 X3

4、12基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1010 基因组文库基因组文库 部分基因文库部分基因文库 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1111 u基因文库基因文库中不是直接保管相中不是直接保管相 应基因，而是应基因，而是保存受体菌保存受体菌，菌，菌 中含基因中含基因 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1212 利用利用PCRPCR提取目的基因提取目的基因 PCRPCR：是一项在生物：是一项在生物体外体外复制特定复制特定DNADNA片段片段 的核酸合成技术。的核酸合成技术。 原理：原理：DNADNA双链复制双链复制 原料：模板原料：模板DNADNA；DN

5、ADNA引物；四种脱氧核苷引物；四种脱氧核苷 酸；热稳定酸；热稳定DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）；离子酶）；离子 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1313 n模板模板DNA （已知碱基序列已知碱基序列） n 特异性引物（特异性引物（DNA） n耐热耐热DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶）酶） n dNTPs （4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸） nMg+(促进促进dNTP与核酸骨架作用与核酸骨架作用) PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1414 PCR的基本反应步骤的基本反应步骤 变性变性 90-95C 延

6、伸延伸 70-75C 退火退火 55-60C 第三步：将反应体系升温第三步：将反应体系升温 至至7075 ，在耐高温的，在耐高温的 DNA聚合酶催化作用下，聚合酶催化作用下， 将与模板互补的单个核苷将与模板互补的单个核苷 酸加到引物所提供的酸加到引物所提供的3-OH 上，使上，使DNA链延伸合成链延伸合成， 产生一条与模板链互补的产生一条与模板链互补的 DNA链。链。 第一步：将反应体系（包括双链模第一步：将反应体系（包括双链模 板、引物、耐高温的板、引物、耐高温的DNA聚合酶、聚合酶、 四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应 所需的离子等）加热至所需的离子等）加热至90

7、95 ， 使双链使双链DNA模板两条链之间的模板两条链之间的氢键氢键 打开，变成单链打开，变成单链DNA，作为互补链，作为互补链 聚合反应的模板。聚合反应的模板。 第二步：将反应体系降温第二步：将反应体系降温 至至5560 ，使，使两种引两种引 物分别与模板物分别与模板DNA链配对链配对 结合结合，这个过程称为复性。，这个过程称为复性。 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1515 53 35 53 35 变性变性 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1616 53 35 5 5A B A B 退火退火 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序171

8、7 53 35 5 5 Taq酶酶 延伸延伸1 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1818 53 35 5 5 延伸延伸2 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1919 () 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2020 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2121 模板DNA 95 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2222 PCR的基本原理 nPCR反应条件 nPCR过程 nPCR的特点50 引物1 引物2 DNA引物 X312基因

9、工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2323 PCR的基本原理 nPCR反应条件 nPCR过程 nPCR的特点 引物1 引物2 DNA引物 72 Taq酶 Taq酶 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2424 PCR的基本原理 nPCR反应条件 nPCR过程 nPCR的特点 72 第1轮结束 第2轮开始 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2525 PCR的基本原理 nPCR反应条件 nPCR过程 nPCR的特点 95 50 72 Taq Taq Taq Taq X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2626 PCR的基本原理 nPCR反应条

10、件 nPCR过程 nPCR的特点 72 第2轮结束 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2727 PCR的基本原理 nPCR反应条件 nPCR过程 nPCR的特点 重复30轮后 230=1,073,741,824 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增 理想拷贝数=2n n 循环次数 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2828 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2929 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序3030 X3

11、12基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序3131 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序3232 QPCR是针对特定是针对特定DNA片断片断 的快速体外复制增殖技术的快速体外复制增殖技术 Q每循环一轮，目的基因的每循环一轮，目的基因的 量可增加一倍量可增加一倍 Q增殖速率为增殖速率为2n,（n为循环为循环 次数）次数） 每完成一个循环需每完成一个循环需2-42-4分钟，分钟，2-32-3小时就小时就 能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序3333 PCRPCR技术扩增过程技术扩增过程 a

12、a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下， 断裂，形成断裂，形成 。 b b、复性（、复性（55-6055-60）：系统温度降低，引物）：系统温度降低，引物 与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部 。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端延伸，合成与模板互补端延伸，合成与模板互补 的的 。 氢键氢键单链单链DNADNA 双链双链 DNADNA链链 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序3434 q从基因文库中获取从

13、基因文库中获取 q利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增 q利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成 归纳：获取目的基因的方法归纳：获取目的基因的方法 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序3535 质粒质粒DNADNA分子分子 切口切口 黏性末端黏性末端 切口切口 获得目的基因获得目的基因 DNA DNA 连接酶连接酶 重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 同一种同一种 限制酶限制酶 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序3636 构建表达载体构建表达载体 组成组成 q目的基因目的基因 q启动子启动子 q终止子终止子 q标记基因标记基因 目的：目的：

14、使目的基因在受使目的基因在受 体细胞中稳定存在；可体细胞中稳定存在；可 以遗传给下一代；使目以遗传给下一代；使目 的基因能够表达和发挥的基因能够表达和发挥 作用。作用。 复制原点复制原点 插入基因插入基因 终止子终止子 抗生素抗性基因抗生素抗性基因 表达载体表达载体 启动子启动子 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序3737 将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞 n农杆菌转化法农杆菌转化法 n基因枪法基因枪法 n花粉管通道法花粉管通道法 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序3838 将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞 n显微注射法显微注射法 （

15、将基因表达载体（将基因表达载体 提纯，用显微仪提纯，用显微仪 注射到受精卵中）注射到受精卵中） X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序3939 将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞 Ca2 处理 处理 受体细胞受体细胞 成为感受成为感受 态细胞，态细胞， 再进行混再进行混 合。合。 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序4040 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定 n检测检测: : q是否插入目的基因是否插入目的基因 q是否转录是否转录 q是否翻译是否翻译 n鉴定鉴定: : q功能活性鉴定功能活性鉴定 q抗性鉴定抗性鉴定 X312基因工程的基本操作

16、程序基因工程的基本操作程序4141 DNA分子杂交技术分子杂交技术 DNA-RNA分子杂交技术分子杂交技术 抗原抗原抗体杂交技术抗体杂交技术 检验受体细胞染色体的检验受体细胞染色体的DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因 检验目的基因是否转检验目的基因是否转 录出了录出了mRNA 检验目的基因是否表检验目的基因是否表 达出了蛋白质达出了蛋白质 个体生物学检验个体生物学检验个体生物学性状观察个体生物学性状观察 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 4242 DNA 附着在膜上附着在膜上 硝化纤维素硝化纤维素 加探针加探针 报告基因（含荧光素分子）报告基因（含荧光素分子）

17、 变性变性 DNA杂交杂交 （如检测（如检测SARS病毒等）病毒等） a b c d X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序4343 检测是否插入检测是否插入目的基因目的基因，利用，利用DNADNA分子杂交技术分子杂交技术，目的基因，目的基因 DNADNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNADNA杂交，看是否有杂交，看是否有 杂交带。杂交带。 检测是否转录出了检测是否转录出了mRNAmRNA，利用，利用DNADNA分子杂交技术，分子杂交技术，目的基因目的基因 DNADNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的一条链（作探针）与受体细胞中提取的mR

18、NAmRNA杂交，看是否有杂交，看是否有 杂交带。杂交带。 检测目的基因是否翻译成检测目的基因是否翻译成蛋白质蛋白质。抗体与蛋白质进行。抗体与蛋白质进行抗原抗原 抗体抗体杂交，看是否有杂交带。杂交，看是否有杂交带。 还可以进行还可以进行个体水平个体水平的鉴定，根据其的鉴定，根据其性状性状。 提示：提示： DNADNA分子杂交技术分子杂交技术首先提取受体细胞中的首先提取受体细胞中的DNADNA，然后高温解成，然后高温解成 单链，再与同位素标记的单链，再与同位素标记的DNADNA探针杂交；探针杂交； 抗原抗体杂交抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动

19、物 进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序4444 大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受 体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中 检测出来。检测出来。 将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中 是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落， 保留有表达产物的进一步培养、研究。保留有表达产物的进一步培养、

20、研究。 无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物 有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序4545 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 n获取目的基因获取目的基因 u从基因文库从基因文库 u利用利用PCR u化学方法人工合成化学方法人工合成 n构建基因表达载体构建基因表达载体 u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因 n将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 u农杆菌转化法、显微注射法农杆菌转化法、显微注射法 n目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定 u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入

21、、转录、翻译 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序4646 1.下表关于基因工程中有关基因操作下表关于基因工程中有关基因操作 的名词及对应的内容，正确的组合是的名词及对应的内容，正确的组合是 2 2、下列属于获取目的基因的方法的是、下列属于获取目的基因的方法的是 利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成 从基因组文库中提取从基因组文库中提取 从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成 A.A. B. B. C. C. D. D. X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序4747 3.细菌的质粒分

22、子带有一个抗菌素抗性基因，该抗细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗 性基因在基因工程中的主要作用是性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测 C增加质粒分子的分子量 D便于与外源基因连接 4.4. 有关基因工程的叙述正确的是有关基因工程的叙述正确的是 A限制酶只在获得目的基因时才用 B重组质粒的形成是在细胞内完成的 C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序4848 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序4949 例、采用基因工程技术将人凝血因

23、子基因导入山羊受 精卵，培育出了转基因羊。但是，人凝血因子只存在 于该转基因羊的乳汁中。以下有关叙述，正确的是 A.人体细胞中凝血因子基因编码区的碱基对数目，等 于凝血因子氨基酸数目的3倍 B.可用显微注射技术将含有人凝血因子基因的重组 DNA分子导入羊的受精卵 C.在该转基因羊中，人凝血因子基因存在于乳腺细 胞，而不存在于其他细胞中 D.人凝血因子基因开始转录后，DNA连接酶以DNA分 子的一条链为模板合成mRNA X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序5050 尝试设计尝试设计 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序5151 1.答：答：不可以。因为目的基因在表

24、达载体中得到表达并发挥不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥 作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基 因等。必须构建上述元件的主要理由是：因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因 的启动子才能比较有利于基因的表达；的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码文库获得的目的基因没有启动子，只将编码 序列导入受体生物中无法转录；序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是

25、否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其 他调控元件，如增强子等；他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么 部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基 因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。 （P15P15） X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作

26、程序5252 2.解析：解析：农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因 工程中以根瘤农杆菌的工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆 菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，约有菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，约有93属属643种种 双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这 些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单 子叶植物也有侵染能力。子叶植物也有侵染

27、能力。 根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌 具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸 引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为 乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细 胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物 不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖

28、，如不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如 L-阿拉伯糖、阿拉伯糖、D-木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既 可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上质粒上 Vir区（毒性区）基因的诱导物，使区（毒性区）基因的诱导物，使Vir区基因活化，导致区基因活化，导致T- DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。的加工和转移，从而侵染植物细胞。 X312基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序5353 需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力 有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农 杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上 述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌 侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。 如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用 农杆菌，但要注意两点：要选择合