发酵工程培养基课件

1、发酵工程培养基1 3 发酵工业培养基设计 发酵工程培养基2 培养基培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长 繁殖繁殖 所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生 物培养提供除营养外的其它所必须的条件。物培养提供除营养外的其它所必须的条件。 发酵培养基的作用：发酵培养基的作用： 满足菌体的生长满足菌体的生长 促进产物的形成促进产物的形成 发酵工程培养基3 工业微生物发酵培养基的共性 单位培养基能够产生最大量的目的产物； 能够使目的产物的合成速率最大； 能够使副产物合成的量最少； 所采用的培养基应该质量稳

2、定、价格低廉、 易于长期获得； 所采用的培养基尽量不影响工业发酵中通 气搅拌性能以及发酵产物的后期处理。 发酵工程培养基4 3.1 发酵工业培养基的基本要求 必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基 本成分； 有利于减少培养基的单耗，即提高单位营 养物质的转化率； 有利于提高产物的浓度，以提高单位容积 发酵罐的生产能力； 有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周 期； 发酵工程培养基5 尽量减少副产物的形成，便于产物的分离 纯化，并尽可能减少产生“三废”物质； 原料价格低廉，质量稳定，取材容易； 所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅 拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能 耗。 发酵工程培养基6 一.

3、碳源 用于构成微生物细胞和代谢产物中碳素的来源，并为微生 物的生长繁殖和代谢活动提供能源。 主要功能 提供微生物生长繁殖所需的能源； 提供微生物合成菌体的碳成分； 提供合成目的产物的碳成分。 工业生产常用的碳源： 糖类、油脂、有机酸、醇和碳氢化合物等。 如碳源贫乏时，蛋白质水解物或氨基酸等也被作为碳 源使用。 3.2 培养基的成分及功能培养基的成分及功能 工业生产所用微生物绝大多数是异养 菌，不像自养菌那样能够利用光、还 原态无机物或碳酸盐作为能源物质， 只能利用有机碳水化合物作为能源。 对于异养微生物，碳源又兼做能源， 称为双功能营养物。 发酵工程培养基7 (1) 糖类：发酵培养基中使用最广

4、泛的碳源。 纯糖 天然原料 木糖木糖单糖：单糖：葡萄糖、葡萄糖、 双糖：双糖：蔗糖、麦芽糖、蔗糖、麦芽糖、 乳糖乳糖 多糖：多糖：淀粉、糊精淀粉、糊精 及其水解液及其水解液 糖糖 蜜蜜 类：类：甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜 糖糖 类：类：麦芽汁麦芽汁 淀粉质类：淀粉质类：山芋粉、马铃薯粉、山芋粉、马铃薯粉、 玉米粉、燕麦粉、玉米粉、燕麦粉、 木薯粉木薯粉 其其 它：它：纤维素水解液、乳清纤维素水解液、乳清 、 碳源物质的易利用顺序：碳源物质的易利用顺序： (单单)葡萄糖葡萄糖 (双双)蔗糖、麦芽糖、乳糖蔗糖、麦芽糖、乳糖 (多多)糊精糊精淀粉淀粉 速效碳源速效碳源 迟效碳源迟效碳源 发

5、酵工程培养基8 葡萄糖是工业发酵中最常用的单糖，它是由淀 粉加工制备的，有固体粉状和葡萄糖糖浆两种 产品形式。 葡萄糖是碳源中最容易利用的单糖，所以常作 为培养基的主要成分，并且也作为促进细胞快 速生长的一种有效的糖类物质。 它被广泛用于抗生素、氨基酸、有机酸、多糖、 甾体转化等发酵产品的生产中。 发酵工程培养基9 但葡萄糖过多会加速菌体的呼吸，在通气不足、 溶解氧不能满足需要的情况下，其代谢中间产物 如丙酮酸、乳酸、乙酸等不完全氧化而积累在菌 体或培养基中，会导致培养基的pH值下降，影响 某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的 合成。 葡萄糖还会引起葡萄糖效应，阻遏微生物利用其 他的糖。

6、 由于葡萄糖等快速利用的糖对产物合成有调节作 用，应控制其浓度，一般是将其和缓慢利用的多 糖组成混合碳源，即有利于菌体生长又有利于产 物形成。 发酵工程培养基10 p“葡萄糖效应”是研究大肠杆菌利用各种不同混合碳源 的时发现的碳分解产物的阻抑作用。当大肠杆菌培养 于含有葡萄糖和乳糖的培养基中，菌体出现两次生长 旺盛期。 葡萄糖效应葡萄糖效应 发酵工程培养基11 p这是大肠杆菌首先利用葡萄糖进行生长繁殖，在 葡萄糖耗尽后，过一段时间菌体才开始利用乳糖 再生长繁殖。后来的酶学试验证实，当葡萄糖存 在时，细菌不利用其他糖。在上述培养基中即使 加入乳糖酶诱导物，葡萄糖没耗尽，利用乳糖的 酶系也不能合成

7、。 p葡萄糖效应是由葡萄糖的某种分解代谢物引起的， 这种代谢物阻遏了细菌能够利用其他糖的酶的生 成。 p后来在许多微生物学的试验中发现，碳分解产物 的阻抑作用普遍存在于微生物的生化代谢中。 葡萄糖效应葡萄糖效应 发酵工程培养基12 工业发酵生产中用的双糖主要有蔗糖、乳糖和 麦芽糖。蔗糖、乳糖可以使用其纯制产品，也 可以使用含有此二糖的糖蜜和乳清，麦芽糖多 用其糖浆。 糖蜜是制糖生产时的结晶后母液，是制糖工业 的副产物，主要含蔗糖(总糖含量可达5075 )、氮素、无机盐和维生素等营养物质，是微 生物发酵培养基价廉物美的碳源。常用在酵母 和丙酮、丁醇的生产中，在酒精生产中，糖蜜 代替甘薯粉，可以省

8、去糖化工序，简化了生产 工艺。 发酵工程培养基13 糖蜜使用的注意点：糖蜜使用的注意点： 除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许 多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。 例：谷氨酸发酵例：谷氨酸发酵 有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶） 生物素（发酵控制）生物素（发酵控制） 预处理：澄清预处理：澄清脱钙脱钙脱除生物素脱除生物素 例：柠檬酸发酵例：柠檬酸发酵 有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）有害物质：铁离子含量高（导致

9、异柠檬酸的生成） 预处理：预处理：黄血盐黄血盐 发酵工程培养基14 糊精、淀粉及其水解液等多糖是仅次于葡萄糖的常用碳源，尤其是 淀粉克服葡萄糖代谢过快的弊病，价格也比较低廉。 玉米淀粉及其水解液多用于抗生素、核苷酸、氨基酸、酶制剂等发 酵；小麦淀粉、燕麦淀粉和甘薯淀粉等常在有机酸、醇等发酵中使 用。 另淀粉有直链淀粉和支链淀粉之分，在培养基中用量较大时，发酵 液比较稠，一般2.0%时要加入一定的-淀粉酶先行水解。 再它们必须水解成单糖后才能被吸收利用。因此所用微生物必须能 够分泌水解淀粉、糊精的胞外酶。 发酵工程培养基15 (2) 油和脂肪 在培养基中糖类物质缺乏或微生物生长的某一阶段， 许多

10、微生物可以利用脂类作为碳源和能源生长。许多 霉菌和放线菌都具有比较活跃的脂肪酶脂肪酶，在脂肪酶的 作用下，油或脂肪被水解为甘油和脂肪酸，在有氧时， 进一步氧化成CO2和H2O，并释放出大量的能量。 可用的油脂类有豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、 棉籽油、玉米油、亚麻子油、橄榄油等。 当微生物利用脂肪作为碳源时，所消耗的氧量增加， 因此要供给比糖代谢更多的氧，不然大量的脂肪酸和 代谢中的有机酸会积累，从而引起pH的下降，并影响 微生物酶系统的作用。 在发酵过程中加入的油脂还兼有消泡的作用。 发酵工程培养基16 (3) 有机酸及其盐类有机酸及其盐类 一些微生物对乳酸、柠檬酸、乙酸、延胡索酸等及其

11、 盐类有很强的氧化能力，因此这些有机酸和它们的盐 也能作为微生物的碳源。 有机酸作为碳源，氧化产生的能量被菌体用于生长繁 殖和代谢产物的合成。 在利用有机酸时，发酵液的pH会随着有机酸氧化而上 升，尤其是有机酸盐氧化时，常伴随着碱性物质的产 生，使pH进一步上升。对整个发酵过程中pH的调节和 控制增加困难。 醋酸盐做为碳源被氧化时，反应如下： CH3COONa + 2O2 2CO2 + H2O + NaOH 发酵工程培养基17 (4) 烃和醇类烃和醇类 近年来随着石油工业的发展，烷烃(一般是从石油裂解 中得到的1418碳的直链烷烃混合物，以及甲烷、乙 烷、丁烷等)用于有机酸、氨基酸、维生素、抗

12、生素和 酶制剂的工业发酵中。 甘油、甲醇、乙醇、山梨醇等也用于发酵碳源或生产 某些单细胞蛋白。其他碳源物质如碳酸气、石油、正 构石蜡、天然气等石油化工产品，也是许多微生物的 碳源。 例如，嗜甲烷棒状杆菌可以利用甲醇为碳源生产单细 胞蛋白，对甲醇的转化率可达47以上。 乳糖发酵短杆菌以乙醇为碳源生产谷氨酸，对乙醇的 转化率为31，产率达78 gL。 发酵工程培养基18 裂烃棒杆菌的青霉素抗性突变株用十六烷作为碳源生产谷 氨酸，在发酵中加入一定浓度的青霉素，谷氨酸产量达84 gL。用正十四烷生产a-酮戊二酸的产率甚至高于其他碳 源。 某些以乙醇作为碳源的菌体得率比用葡萄糖作为碳源还高。 乙醇葡萄糖

13、醋酸 正烷烃(C18) 甲醇甲烷 含碳量/%52.240408537.575 菌体得率/ (g细胞/g碳源) 0.830.500.431.400.670.88 发酵工程培养基19 例：地衣芽孢杆菌生产例：地衣芽孢杆菌生产-淀粉酶淀粉酶 碳源对生长和产酶的影响碳源对生长和产酶的影响 碳源碳源 细胞量细胞量 -淀粉酶淀粉酶 葡萄糖葡萄糖 4.2 0 蔗糖蔗糖 4.02 0 糊精糊精 3.06 38.2 淀粉淀粉 3.09 40.2 发酵工程培养基20 李江华，无锡轻工大学学报，2004 (半纤维素酶) (1.5g麸皮) 发酵工程培养基21 嗜碱芽胞杆菌(AC-2)中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响 结

14、果：各种碳源相差不大 推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型 苏勤，林业化学与工业，2004 发酵工程培养基22 3.2 3.2 培养基的成分及功能 二. 氮源 氮源是指构成微生物细胞物质和代谢产物的氮素 的来源。 其主要功能是： 构成微生物细胞结构物质，如氨基酸、蛋白质、 核酸等； 合成含氮代谢产物； 作为酶的组成分或维持酶的活性； 调节渗透压、PH值、氧化还原电位等； 当培养基中碳源不足时，可作为补充碳源。 生产疫苗时通常用牛血清蛋白、牛肉汁等蛋白质作为碳源。生产疫苗时通常用牛血清蛋白、牛肉汁等蛋白质作为碳源。 发酵工程培养基23 3.2 3.2 培养基的成分及功能 氮源的种类 无机氮源无机氮

15、源 有机氮源有机氮源 氨基氮：氨基氮： NH4OH (NH4)2SO4 NH4NO3 NH4 Cl 硝态氮：硝态氮： NaNO3 KNO3 合成产物：尿素合成产物：尿素 天然原料：天然原料： 植物蛋白：黄豆饼粉、花生饼粉、植物蛋白：黄豆饼粉、花生饼粉、 棉籽饼粉、菜籽饼粉、棉籽饼粉、菜籽饼粉、 麦麸、麦麸、 玉米浆、玉米麸质粉玉米浆、玉米麸质粉 动物蛋白：蛋白胨、鱼粉、动物蛋白：蛋白胨、鱼粉、 蚕蛹粉、牛肉膏蚕蛹粉、牛肉膏 微生物蛋白：酵母粉微生物蛋白：酵母粉/浸膏、浸膏、 废菌丝粉废菌丝粉 其它：酒糟等其它：酒糟等 工业上常用的有机氮源都是工业上常用的有机氮源都是 一些廉价的原料或副产品。一

16、些廉价的原料或副产品。 发酵工程培养基24 3.2 3.2 培养基的成分及功能 p无机氮源 铵盐(NH4)2SO4 、 (NH4)2Cl、 NH4NO3 )、 硝酸盐(NaNO3、KNO3 ) 氨水等。 特点有： 成分简单，质量稳定；成分简单，质量稳定； 易被菌体吸收利用；易被菌体吸收利用； 铵盐中的NH4+与细胞中有机氮处于相同的氧化水平(细胞内的含氮 物质也都以氨基或亚氨基的形式存在)，可被菌体直接吸收用于合 成细胞物质；因此NH3H2O最容易利用，(NH4)2SO4次之。硝酸盐 中的硝态氮需还原成氨后才能被微生物吸收利用，因此铵盐比硝 酸盐能更快被微生物利用。 发酵工程培养基25 无机氮

17、源被微生物利用后常会引起发酵液pH的变化 铵态氮和硝基氮氮源同化结果： (NH4 )2 SO42NH3+H2SO4：NH3被菌体利用，留下H2SO4 则使pH值下降； NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH ：NH3被菌体利用， 留下NaOH使pH值上升； 经过微生物代谢作用后能产生酸性物质的营养成分称为 生理酸性物质；生理酸性物质使pH值下降； 经过微生物代谢作用后能产生碱性物质的营养成分称为 生理碱性物质；生理碱性物质使pH值上升。 正确使用生理酸性物质和生理碱性物质，对稳定和调节 发酵过程的pH有积极作用。 发酵工程培养基26 氨水是发酵工业常用的无机氮源，除了作为氮

18、源之外，还可以 调节pH，在许多微生物发酵生产中都有通氨工艺。 例如在青霉素、链霉素、四环类抗生素的发酵生产中采用 通氨工艺后，发酵单位均有不同程度的提高。 在红霉素的发酵生产中通氨工艺不仅可以提高红霉素的产 量，而且可以增加有效组分的比例。 在采用通氨工艺时应注意两个问题： 一是氨水碱性较强，因此在使用时要防止局部过碱，应少 量多次加入，并强强搅拌； 二是氨水中含有多种嗜碱性微生物，因此在使用前要用石 棉等过滤介质进行过滤除菌，防止因通氨而引起的染菌。 发酵工程培养基27 毛霉产蛋白酶的研究 陈涛，中国酿造，2004 初始pH的影响:pH偏酸比较好，中性蛋白酶影响大 发酵工程培养基28 无机

19、氮源的影响： 硫酸铵硝酸铵硝酸钠尿素 发酵工程培养基29 2、有机氮源、有机氮源 来源来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼花生饼 粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋 白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒 糟糟。 成分复杂成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机 盐及生长因子。盐及生长因子。 例如例如 玉米浆：可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸玉米浆：可溶性蛋白、生长

20、因子（生物素）、苯乙酸 较多的乳酸较多的乳酸 硫、磷、微量元素等硫、磷、微量元素等 发酵工程培养基30 有机氮源在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基 酸被菌体吸收利用，或进一步分解，最终用于合成菌 体的细胞物质和含氮的目的产物。其主要作用有： 除含有丰富的蛋白质、多肽和游离氨基酸外，还含 有糖类、脂肪、无机盐、维生素及某些生长因子，因 而微生物在含有机氮的培养基中表现出生长旺盛、菌 丝浓度增加迅速的特点。 在配制培养基时，应该将其他物质的含量充分考虑进去。 发酵工程培养基31 有机氮源还能提供次级代谢产物的氮素来源，影 响微生物次级代谢产物的产量和组分。更为重要的是 还含有目的产物合成所需的

21、诱导物、前体等物质。 玉米浆中含有的磷酸肌醇对红霉素、链霉素、青霉 素和土霉素等的生产有促进作用； 植物蛋白胨能够提高麦白霉素A1组分的产量； 酵母膏含有利福霉素生物合成的诱导物。 因此，有机氮源是影响发酵水平的重要因素之一。 发酵工程培养基32 某些氨基酸不仅能作为氮源，而且是微生物药物的前体物质， 因此在培养基中直接加入这些氨基酸可以提高代谢产物的产 量。 在培养基中加入缬氨酸可以提高红霉素的发酵单位，因为在此发酵过程 中缬氨酸既是菌体的氮源，又是红霉素生物合成的前体。 玉米浆中的苯乙酸和苯丙氨酸有合成青霉素G的前体作用； 色氨酸是合成硝吡咯菌素和麦角碱的前体。 L-色氨酸，可使螺旋霉素产

22、量明显提高，但L-赖氨酸的加入则会完全抑 制了螺旋霉素的生物合成。 甲硫氨酸和苏氨酸的存在可减少赖氨酸的产量。 但是，由于氨基酸成本高，一般不直接使用，而是通过有机氮源的 分解来获得氨基酸。 发酵工程培养基33 常用的有机氮源 黄豆饼粉是发酵工业中最常用的有机氮源。但是， 黄豆的产地和加工方法不同，营养物质种类、水 分和含油量也随之不同，对菌体的生长和代谢有 很大影响。 根据油脂的含量： 根据加工方法不同： 全脂黄豆粉(油脂含量在18以上) 低脂黄豆粉(含油脂量9以下) 脱脂黄豆粉(含油脂量2以下)。 热轧黄豆饼粉 冷轧黄豆饼粉 发酵工程培养基34 玉米浆是玉米淀粉生产中的副产品，为黄褐色的浓

23、稠不透明的絮状 悬浮物，是一种很容易被微生物利用的氮源。 玉米浆有玉米浆粉和液态玉米浆(干物质含量住50左右)两种，它 们除了含有丰富的氨基酸(丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸、缬氨酸、苯 丙氨酸)，还含有还原糖、有机酸、磷、微量元素和生长因子。 由于玉米浆含有较多的有机酸(如乳酸、苯乙酸 )，其pH偏低，一 般在4.0左右。 玉米的来源和加工条件不同，玉米浆的质量常有较大的波动，对菌 体生长和代谢有很大的影响。 其中含有的磷酸肌醇对红霉素、链霉素、土霉素等的生产有促进作 用；苯乙酸和苯丙氨酸有青霉素前体的作用 。 发酵工程培养基35 蛋白胨是由动物组织或植物蛋白质经酶或酸水解而获 得的由胨、肽、氨基酸

24、组成的水溶性混合物，经真空 干燥或喷雾干燥后制得的产品。 原材料和加工工艺的不同，蛋白胨中营养成分的组 成和含量差异较大。 酵母粉一般是啤酒酵母或面包酵母的菌体粉碎物； 酵母膏是以酵母为原料，经酶解、脱色脱臭、分离和 低温浓缩(喷雾干燥)而制成的。酵母粉和酵母膏都含有 蛋白质、多肽、氨基酸、核甘酸、维生素和微量元素 等营养成分。 发酵工程培养基36 鱼粉是一种优质的蛋白质原料，约含60左右 的粗蛋白，还含有游离氨基酸、脂肪、氯化钠 和微量元素等成分。 尿素因其成分单一，所以不具有其他有机氮源 的特点。但在青霉素和谷氨酸等生产中仍常被 采用。在谷氨酸生产中，尿素可以使a-酮戊二 酸还原并氨基化，

25、提高谷氨酸的产量。 发酵工程培养基37 工业上常用的有机氮源及含氮量工业上常用的有机氮源及含氮量(质量分数质量分数/%) 氮源氮源含氮量含氮量氮源氮源含氮量含氮量 大麦大麦1.52.0花生粉花生粉8.0 甜菜糖蜜甜菜糖蜜1.52.0燕麦粉燕麦粉1.52.0 甘蔗糖蜜甘蔗糖蜜1.52.0大豆粉大豆粉8.0 玉米浆玉米浆4.5乳清粉乳清粉4.5 n有机氮源都来自天然产物，受产地不同、加工方法不同，其质量 不稳定，常引发发酵水平波动，因此，选择有机氮源时，要注意 品种、产地、加工方法、贮藏条件对发酵的影响，注意它们与菌 体生长和代谢产物合成的相关性。 发酵工程培养基38 根据被微生物利用速度的不同，

26、氮源也分为速效氮源 和迟效氮源。 无机氮源或以蛋白质降解产物形式存在的有机氮，如 玉米浆，可以直接被菌体吸收利用，这些氮源被称为 速效氮源。 黄豆饼粉和花生饼粉、酵母膏等，有机氮源中所含的 氮存在于蛋白质中，必须在微生物分泌的蛋白酶作用 下，水解成氨基酸和多肽以后，才能被菌体直接利用， 它们则被称为迟效氮源。 发酵工程培养基39 速效氮源通常有利于菌体的生长，但在微生物药物的发酵生产中也会 出现类似于葡萄糖效应的现象“铵阻遏”效应，即由于速效氮源 (特别是铵)被微生物快速吸收利用而使其中间代谢物阻遏了次级代谢 产物的合成，使次级代谢产物的产量大幅度下降。 迟效氮源一般有利于代谢产物的形成. 因

27、此，在抗生素发酵过程中，往往将速效氮源和迟效氮源、有机氮源 和无机氮源按一定比例配成混合氮源，以控制菌体生长与目的代谢产 物的形成，达到提高抗生素产量的目的。 早期：加入易同化的氮源无机氮源或速效氮源； 中期：菌体的代谢酶系已形成，则可利用迟效氮源。 发酵工程培养基40 三. 无机盐及微量元素 微生物在生长繁殖和代谢产物的合成过程中，还需 要某些无机离子如硫、磷、镁、钙、钠、钾、铁、 铜、锌、锰、钼和钴等。 各种不同的产生菌以及同一种产生菌在不同的生长 阶段对这些物质的需求浓度是不相同的。 无机盐及微量元素对微生物生理活性的作用与其浓 度相关，一般它们在低浓度时对微生物生长和目的 产物的合成有

28、促进作用，在高浓度时常表现出明显 的抑制作用。 发酵工程培养基41 硫、磷、镁、钙、钠、钾硫、磷、镁、钙、钠、钾等元素所需浓度相对较大，一般在 10-310-4mol/L，范围内，属大量元素，在配制培养基时需以无 机盐的形式加入。 而铁、铜、锌、锰、钼和钴铁、铜、锌、锰、钼和钴等所需浓度在10-610-8mol/L范围内， 属微量元素。由于天然原料和天然水中微量元素都以杂质等状态 存在，因此，存配制复合培养基时一般不需单独加入，配制合成 培养基或某个特定培养基时才需要加入。 不同的微生物对于一种元素的需求有很大的差别，例如铁的需要 量在有的产生菌中属大量元素，而在有的产生菌中需要量很少， 只是

29、微量元素。 发酵工程培养基42 无机离子在菌体生长繁殖和代谢活动中的生理功能 是多方面的。 构成菌体成分； 作为酶的组成部分； 酶的激活剂或抑制剂； 调节培养基渗透压； 调节pH值； 维持氧化还原电位等。 发酵工程培养基43 尽管在培养基的天然原料中含有一定量的磷元素和硫元 素，但磷源和硫源往往以磷酸盐和硫酸盐的形式加入培 养基中。 磷源 常用磷源：Na2HPO412H2O、NaH2PO42H2O、K2HPO4、 KH2PO4、K3PO43H2O、K3PO4。 微生物对磷的需要量一般为0.0050.01 molL。 发酵工程培养基44 磷源素在微生物生长和代谢调节中，磷具有重要的生 理功能。

30、磷是核酸、磷脂、辅酶或辅基(如辅酶l、辅酶、辅酶A) 等物质的组成成分； 磷是能量传递物质三磷酸腺甘(ATP)的组成成分； 磷酸盐还是重要的缓冲剂，可以缓冲发酵过程中pH的变 化。 发酵工程培养基45 磷酸盐在代谢调节方面起着重要的作用。 磷酸盐能促进糖代谢的进行，有利于微生物的生长繁殖。 磷酸盐对次级代谢产物的合成具有调节作用，如在链霉素、土霉 素和新生霉素等的生物合成中，低浓度的磷酸盐能促进产物的合 成，但高浓度的磷酸盐则抑制产物的合成。 磷酸盐还能调节代谢流向，如在金霉素发酵过程中，金色链霉菌 能通过糖酵解途径和单磷酸已糖途径利用糖类，而且金霉素的生 物合成与单磷酸己糖途径密切相关。当磷

31、酸盐浓度较高时，有利 于糖酵解途径的进行，导致初级代谢旺盛、菌丝大量生成和丙酮 酸积累，使单磷酸己糖途径受到抑制，从而降低了金霉素的合成。 发酵工程培养基46 硫源多用其盐 MgSO4 ，即含硫也含镁。 硫是蛋白质中含硫氨基酸和某些维生素的组成成分 半胱氨酸、甲硫氨酸、辅酶A、生物素、硫胺素 等都含有硫，活性物质谷胱甘肽中也含有硫。 硫还是某些抗生素如青霉素、头孢菌素的组成元 硫酸镁加入培养基中，在碱性条件下会形成氢氧化 镁沉淀，因此配制培养基时要注意pH的影响。 发酵工程培养基47 镁是代谢途径中许多重要酶(如己糖磷酸化酶、 柠檬酸脱氢酶、烯醇化酶、羧化酶等)的激活剂。 镁离子不但影响基质的

32、氧化，还影响蛋白质的合 成。 对一些氨基糖苷类抗生素(如卡那霉素、链霉素、 新霉素)的产生菌，镁离子能促使与菌体结合的 抗生素向培养液中释放，提高菌体对自身所产生 抗生素的耐受能力。 发酵工程培养基48 铁是菌体的细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化物酶的组成 部分，是菌体生命活动必需的元素之一。但铁离子的含量对 多种代谢产物的生物合成有较大的影响。 在青霉素、四环素、麦迪霉素等发酵中，Fe2+的浓度要小于 20g/ ml，超过之就具有较强的抑制作用，产量显著下降。因 此，这些产品的发酵应使用不锈钢发酵罐。 一些天然原料中都含有铁，所以发酵培养基一般不再加入含 铁化合物。 采用铁制发酵罐时，使用前

33、要用稀硫酸铵或稀硫酸溶液预处 理几次，再用未接种的培养基运转几批，去除罐壁上铁离子， 然后才能正式投入生产。 发酵工程培养基49 钠、钾、钙虽不参与细胞的组成，但仍是微生物发酵培养 基的必要成分。 钠离子与维持细胞渗透压有关，故在培养基中常加入少量 钠盐，但用量不能过高，否则会影响微生物的生长。 钾离子也与细胞渗透压和细胞膜的通透性有关，并且还是 许多酶(如磷酸丙酮酸转磷酸酶、果糖激酶)的激活剂，能 促进糖代谢。 谷氨酸发酵产物生成所需要的钾盐比菌体生长需要量高。 钾盐少，长菌体；钾盐足够产谷氨酸。 发酵工程培养基50 钙离子 钙离子是某些蛋白酶的激活剂； 钙离子参与细胞膜通透性的调节； 钙离

34、子是细菌形成芽孢和某些真菌形成孢子所必需的； 常用的碳酸钙不溶于水，几乎是中性，但它能与微生物 代谢过程中产生的酸起反应，形成中性盐和二氧化碳， 后者从培养基中逸出，因此碳酸钙对培养液pH的变化有 一定的缓冲作用。 发酵工程培养基51 在配制培养基时应对钙元素注意三点： 一是钙盐过多会形成磷酸钙沉淀而降低培养基中可溶 性磷的含量，因此当培养基中磷和钙浓度较高时，应 将两者分别消毒或逐步补加； 二是先将除CaCO3以外的培养基用碱调到pH接近中性， 再将CaCO3加入到培养基中，这样可防止CaCO3在酸 性培养基中被分解而失去其在发酵过程中的缓冲能力； 三是要严格控制碳酸钙中 CaO等杂质的含量

35、。 发酵工程培养基52 微量元素： Zn、Co、Mn、Cu等元素大部分作为酶的辅基和激活 剂；需量微少，但又不可缺少。 锌离子是碱性磷酸酶、脱氢酶、肽酶的组成成分； 钴离子是肽酶的组成成分； 锰离子是超氧化物歧化酶、氨肽酶的组成成分； 铜离子是氧化酶、酪氨酸酶的组成成分。 发酵工程培养基53 对于某些特殊的菌株和产物，有些微量元素具有独特 的作用，能促进次级代谢产物的生物合成。 微量的锌离子能促进青霉素、链霉素的合成； 微量的锰离子能促进芽孢杆菌合成杆菌肽； 钴离子是维生素B12的组成元素，在发酵中加入一定量的钴离 子能使维生素B12的产量提高数倍；微量的钴离子还能增加庆 大霉素和链霉素的产量

36、。 微量元素因需要量很少，除了合成培养基，一般复合 培养基中作为碳、氮源的农副产品天然原料中，本身 就含有某些微量元素，不必另加； 发酵工程培养基54 五五. 生长调节物质生长调节物质 生长因子生长因子 生长因子是微生物生长代谢必不可少，但不能 用简单的碳源或氮源生物合成的一类特殊的营 养物质。 根据化学结构及代谢功能，生长因子主要有三类： 维生素 氨基酸 及其衍生物 碱基 此外还有脂肪酸、卟啉、甾醇等。 发酵工程培养基55 维生素：是被发现的第一类生长因子。大多数维生 素是辅酶的组成成分， 硫胺素(维生素B1)是脱羧酶、转醛酶、转酮酶的辅基， 核黄素(维生素B2)是FMN和FAD的组成成分，

37、 烟酸(维生素B5)是辅酶和辅酶的组成成分。 微生物对维生素的需求量较低，一般是150g/L， 有时甚至更低。 发酵工程培养基56 氨基酸： L-氨基酸是蛋白质的主要组成成分， 有的D-氨基酸是细菌细胞壁和生理活性物质的组成 成分。 作为生长因子的氨基酸其添加量一般为2050g/L。 添加时，可以直接提供氨基酸，也可以提供含有所 需氨基酸的小肽。 发酵工程培养基57 碱基： 碱基包括嘌呤和嘧啶，其主要功能是： 用于合成核酸和一些辅酶及辅基。 有些产生菌可利用核苷、游离碱基作为生长因子， 有些产生菌只能利用游离碱基。 核苷酸一般不能作为生长因子，但有些产生菌既不 能合成碱基，又不能利用外源碱基，

38、需要外源提供 核苷或核苷酸，而且需要量很大。 发酵工程培养基58 不同的产生菌所需的生长因子各不相同，有的需要多种生长因子， 有的仅需要一种，还有的不需要生长因子。 同一种产生菌所需的生长因子也会随生长阶段和培养条件的不同而 有所变化。 生长因子的需要量一般很少。天然原料，如 如酵母膏、 玉米浆、 麦芽浸出液、 肝浸液 或其他新鲜的动植物浸液 都含有丰富的生长因子，因此配制复合培养基时，不需单独添加生 长因子。 有机氮源是生长因子的重要来源，有机氮源是生长因子的重要来源， 多数有机氮源含有较多的多数有机氮源含有较多的B族维生族维生 素和微量元素以及生长因子。素和微量元素以及生长因子。 发酵工程

39、培养基59 几种生长因子的主要功能 生长因子主要功能 维生素B1脱羧酶、转醛酶、转酮酶的辅基 维生素B2黄素蛋白的辅基，与氢的转移有关 维生素B6辅基，与氨基酸的脱羧、转氨基有关 生物素各种羧化酶的辅基 维生素B12 钴酰胺的辅酶，与甲硫氨酸和胸腺嘧啶核苷 酸的合成和异构化有关 叶 酸辅酶F，与核酸的合成有关 泛 酸乙酰载体的辅基，与酰基转移有关 维生素K电子传递 尼克酸脱氢酶的辅基 n谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为 生长因子，生长因子对发酵的调控起到重要的 作用 。 n赖氨酸产生菌几乎都是谷氨酸产生菌的突变株， 均为生物素缺陷型，同时也是某些氨基酸如高 丝氨酸的缺陷型，因此需要生物

40、素和某些氨基 酸作为生长因子。 发酵工程培养基60 前体 在微生物代谢产物的生物合成过程中，有些化合物能直接被微生物 利用构成产物分子结构的一部分，化合物本身的结构没有大的变化， 这些物质称为前体。 在青霉素发酵时，人们发现添加玉米浆后，青霉素单位可从 20g/Lml增加到l00g/ml。进一步研究表明，发酵单位增加的主要 原因是玉米浆中含有苯乙酰胺，它能被优先结合到青霉素分子中， 从而提高了青霉素G的产量。 青霉素青霉素 苯乙酸苯乙酸 发酵工程培养基61 前体必须通过产生菌的生物合成过程，才能掺入到产物的分子结构 中。 在一定条件下，前体可以起到控制菌体代谢产物的合成方向和增加 产量的作用。

41、例如在青霉素发酵中加入苯乙酸或苯乙酰胺可以提高 青霉素G的产量，而且使青霉素G的比例提高到99%，若不加入前体， 青霉素G只占青霉素总量的20%30%。 根据前体的来源，可将前体分为外源性前体和内源性前体。 外源性前体是指产生菌不能合成或合成量极少，必须由外源添加到 培养基中供给其合成代谢产物，如青霉素G的前体苯乙酸、青霉素V 的前体苯氧乙酸。外源性前体是发酵培养基的组成成分之一。 发酵工程培养基62 内源性前体是指产生菌在细胞内能自身合成的、用来 合成代谢产物的物质，如头孢菌素C生物合成中的-氨 基己二酸、半胱氨酸和缬氨酸是内源性前体。 需要注意的是：有些外源性前体物质，如苯乙酸、丙 酸等浓

42、度过高会对菌体产生毒性；此外，有些产生菌 能氧化分解前体，因此在生产中为了减少毒性和提高 前体的利用率，补加前体宜采用少量多次的间歇补加 方式或连续流加的方式。 发酵工程培养基63 抗生素抗生素前体物质前体物质 青霉素G苯乙酸或在发酵中能形成苯乙酸的物质，如苯乙 基酰胺等 青霉素O烯丙基硫基乙酸 青霉素V苯氧乙酸 放线菌素C3肌氨酸 链霉素肌醇、精氨酸、甲硫氨酸 金霉素氯化物 溴四环素溴化物 红霉素丙酸、丙醇、丙酸盐、乙酸盐 灰黄霉素氯化物 抗生素发酵常用的前体物质抗生素发酵常用的前体物质 发酵工程培养基64 氨基酸发酵的前体物质 氨基酸菌体前体物质产量 丝氨酸嗜甘油棒状杆菌甘氨酸1.6 %

43、色氨酸异常汉逊酵母氨茴酸0.8 % 色氨酸麦角菌吲哚1.3 % 蛋氨酸脱氢极毛杆菌2-羟基4-甲基硫代丁醇1.1 % 异亮氨酸粘质赛杆菌-氨基丁酸0.8 % 异亮氨酸阿氏棒状杆菌D-苏氨酸1.5 % 苏氨酸谷氨酸小球菌高丝氨酸2.0 % 发酵工程培养基65 诱导物 诱导物一般是指一些特殊的小分子物质，在微生物发 酵过程中添加这些小分子物质后，能够诱导代谢产物 的生物合成，从而显著提高发酵产物的产量。 根据诱导物的来源，可将诱导物分为内源性诱导物和 外源性诱导物。 发酵工程培养基66 内源性诱导物又称为内源性诱导因子或自身调节因子， 是在微生物的代谢过程中产生的调节因子， 如链霉素的产生菌灰色链

44、霉菌的发酵液中有一种被称 为A因子的物质能够使不产链霉素的突变株恢复产生链 霉素，其他还有I因子、L因子、Grafe因子等。 外源性诱导物又称为外源性诱导因子，是添加在培养 基中的外源性物质， 如存在于酵母膏中的B因子(3-l-磷酸丁酰-腺苷)，添加 B因子可使利福霉素产生菌的生产能力成倍增长。 发酵工程培养基67 促进剂和抑制剂 在发酵培养基中加入某些微量的化学物质，可促进目的代 谢产物的合成，这些物质被称为促进剂。 在四环素的发酵培养基中加入硫氰化苄或2-巯基苯并 噻唑可控制三羧酸循环中某些酶的活力，增强戊糖循 环，促进四环素的合成。 促进剂 抗生素 促进剂 抗生素 -吲哚乙酸、-萘乙酸、

45、硫氰酸苄酯 金霉索 硫氰化苄、2-巯基苯并噻唑 四环素 甲硫氨酸、亮氨酸 头孢菌索 丙氨酸、异亮氨酸 阿弗米丁 色氨酸 麦角甾醇类 巴比妥 链霉素 巴比妥 利福露索 巴比妥 加利红菌素 环糊精 兰卡霉素 苯丙氨酸 圆弧菌素 发酵工程培养基68 在发酵过程中加入某些化学物质会抑制某些代谢 途径的进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而 获得人们所需的某种代谢产物，或使正常代谢的 中间产物积累起来，这种物质被称为抑制剂。 如在四环素发酵时，加入溴化物可以抑制金霉素的 生物合成，而使四环素的合成加强。 在利福霉素B发酵时，加入二乙基巴比妥盐可抑制 其他利福霉素的生成。 发酵工程培养基69 促进的抗生素被

46、抑制的产物抑制剂 链霉素甘露糖链霉素甘露聚糖 去甲基链霉素链霉素乙硫氨酸 四环素金霉素溴化物、巯基苯并噻唑、 硫脲嘧啶、硫脲 去甲基金霉素金霉素磺胺化合物、乙硫氨酸 头孢菌素C头孢菌素NL-蛋氨酸 利福霉素B其他利福霉素巴比妥药物 抗生素生产中应用的促进剂或抑制剂抗生素生产中应用的促进剂或抑制剂 发酵工程培养基70 发酵工程培养基71 六、水六、水 对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在 不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。 水源质量的主要考虑参数包括水源质量的主要考虑参数

47、包括pH值、溶解氧、可溶性值、溶解氧、可溶性 固体、污染程度以及矿物质组成和含量。固体、污染程度以及矿物质组成和含量。 对于酿造行业，水的重要性不言而喻对于酿造行业，水的重要性不言而喻 对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。 发酵工程培养基72 3.3 培养基的类型 斜面培养基或孢子培养基斜面培养基或孢子培养基 种子培养基种子培养基 发酵培养基发酵培养基 发酵工程培养基73 孢子培养基 要求：能使菌体生长快，产生孢子数量大、质量 好，且不会引起菌种变异。 特点 C、N源不宜多，否则只长菌丝，少长或不长孢 子； 无机盐浓度要适

48、当控制，否则会影响孢子的颜 色和孢子量。 发酵工程培养基74 种子培养基 要求 营养丰富、完全，氮和维生素的含量高些； 培养基中加入一些易于吸收利用的速效C、N源， 便于孢子发芽生长，保证球形； pH要稳定； 最后一级尽可能接近发酵培养基，常加入少量 发酵合成期才大量需要的物质。 发酵工程培养基75 发酵培养基 目的：使接种菌丝生长并能高效表达，获得高的发酵产量，同 时组分尽可能单一，以保证高的得率。 要求 营养丰富完全，有利于产物合成； 不能大量加入速效C、快N源，应和迟效C、N源相结合； 在产物分泌期间，pH 稳定； 加入适量合成所需的物质，如前体等，进行定向发酵； 采用中间补料，以提高发

49、酵单位； 原料的考虑成本问题 发酵工程培养基76 问题来了！问题来了！ 交给你一个菌株，让你拿出一个对该菌株最好的 培养基配方，你如何做？ 发酵工程培养基77 第四节 发酵培养基的设计原理和优化方法 目前还不能完全从生化反应的基本原理来推目前还不能完全从生化反应的基本原理来推 断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用 生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论， 参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方， 再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃再结合所用菌种

50、和产品的特性，采用摇瓶、玻璃 罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验 方法选择出较为适合的培养基。方法选择出较为适合的培养基。 发酵工程培养基78 一、培养基成分选择的原则 q 菌种的同化能力菌种的同化能力 q 代谢的阻遏和诱导代谢的阻遏和诱导 q 合适的合适的C、N比比100 0.22.0 q pH的要求的要求 发酵工程培养基79 1 1 菌体的同化能力菌体的同化能力 由于微生物来源和种类的不同，所能分泌 的水解酶系不同。 2 2 培养基对菌体代谢的阻遏和诱导培养基对菌体代谢的阻遏和诱导 发酵工程培养基80 3 碳源和氮源的浓度和比例 对于孢子培

51、养基来说，营养不能太丰富(特别是有机氮源)，否 则不利产孢子； 对于发酵培养基来说既要利于菌体的生长，又能充分发挥菌 种合成代谢产物的能力。 碳源与氮源的比例是一个影响发酵水平的重要的因素。因为碳源 既作为碳架参与菌体和产物合成又作为生命活动的能源，所以一 般情况下，碳源用量要比氮源用量高。 应该指出的是：碳氮比也随碳源和氮源的种类以及通气搅拌等条 件而异，因此很难确定一个统一的比值。 发酵工程培养基81 碳氮比偏小，菌体生长旺盛，但易造成菌体提前衰老 自溶，影响产物的积累； 碳氮比过大，菌体繁殖数量少，不利于产物的积累。 碳氮比合适，但碳源和氮源浓度偏高，会导致菌体的 大量繁殖，发酵液黏度增

52、大，影响溶解氧浓度，容易 引起菌体的代谢异常，影响产物合成。 碳氮比合适，但碳源和氮源浓度过低，会影响菌体的 繁殖，同样不利于产物的积累。 发酵工程培养基82 在四环素发酵中，当发酵培养基的碳氮比维持在25:1时， 四环素产量较高。 除此以外，对于一些快速利用的碳源和氮源，要避免浓 度过高导致的分解产物阻遏作用。 如葡萄糖浓度过高会加快菌种的呼吸，使培养基中的溶 解氧不能满足菌体生长的需要，葡萄糖分解代谢进入不 完全氧化途径，一些酸性中间代谢产物会累积在菌体或 培养基中，使pH降低，影响某些酶的活性，从而抑制微 生物的生长和产物的合成。 发酵工程培养基83 4 生理酸性物质和生理碱性物质的比例

53、 生理酸性物质和生理碱性物质的用量也要适当，否则会引起发酵过程 中发酵液的pH大幅度波动，影响菌体生长和产物的合成。 因此，要根据菌种 在现有工艺和设备条件， 生长和合成产物时pH的变化情况 最适pH的控制范围(一般霉菌和酵母菌比较适于微酸性环境，放线 菌和细菌适于中性或微碱性环境) 综合考虑生理酸碱物质及其用量，从而保证在整个发酵过程中pH都能 维持在最佳状态。 发酵工程培养基84 （一）、（一）、理论转化率与实际转化率理论转化率与实际转化率 理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途 径进行物料衡算，所得出的转化率的大小。径进行物料衡算，所得出的转

54、化率的大小。 实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小 如何使实际转化率接近于理论转化是发酵控制的一个目标如何使实际转化率接近于理论转化是发酵控制的一个目标 二、成分含量的确定二、成分含量的确定 发酵工程培养基85 例例: 如在酒精生产中葡萄糖转化为酒精的理论转化率如在酒精生产中葡萄糖转化为酒精的理论转化率 计算如下计算如下 葡萄糖转化为酒精的代谢总反应衡算式为葡萄糖转化为酒精的代谢总反应衡算式为 C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 葡萄糖转化为酒精的理论得率为葡萄糖转化为酒精的理论得率为 2*46 Y = = 0.52 176 发酵工程培养基

55、86 发酵工程培养基87 （二）、实验设计 q 培养基成分的含量最终都是通过实验获得的 q 合理的实验方法 多因子实验：均匀设计、 正交实验设计、 响应面分析等。 多因子实验 发酵工程培养基88 当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适 的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采 用一些合理的实验设计方法。 三、培养基设计的步骤 根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑 的问题，初步确定可能的培养基成分； 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分； 发酵工程培养基89 方法方法 结果结果 培养基优化的基本方法培养基优化的基本方法 正交正交 实验实验 均匀均匀 设计设计 神经神经

56、 网络网络 其他其他 方法方法 聚类聚类 分析分析 响应面响应面 分析分析 单因子单因子 实验实验 成本成本 发酵单位发酵单位 发酵工程培养基90 类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化 郭秒,食品与工业发酵，2004 类胡萝卜素的作用：色素、营养保健 发酵工程培养基91 原培养基: 发酵工程培养基92 通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例) 考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源 进一步：乙酸钠的浓度2%比较好 发酵工程培养基93 结果： 碳源：乙酸钠 0. 2% 氮源：氯化铵 0.2% 酵母膏0.03% 无机盐: 复合无机盐0.05% 发酵工程培养基94 正交设计确定优化的配方 发酵工程培养基95 发酵工程培养基96 改进后培