植物基因工程08级课件

1、 一、植物基因工程的发展现状一、植物基因工程的发展现状 1、植物的遗传改良方法、植物的遗传改良方法 传统的育种方法传统的育种方法 以以基因突变体基因突变体为种质基础，以为种质基础，以有性杂交有性杂交为基因导入手段，为基因导入手段， 以以选择优良基因型重组体选择优良基因型重组体为目的的植物性状的改良过程。为目的的植物性状的改良过程。 植物基因工程植物基因工程 以以植物为受体植物为受体的一种基因操作，即以的一种基因操作，即以分子生物学分子生物学为理论为理论 基础，采用基础，采用基因克隆、遗传转化基因克隆、遗传转化，以及，以及细胞、组织培养细胞、组织培养 技术技术将外源基因转移并整合到受体植物的基因

2、组中，并将外源基因转移并整合到受体植物的基因组中，并 使其在后代植株中得以正确表达和稳定遗传，从而使受使其在后代植株中得以正确表达和稳定遗传，从而使受 体获得新性状的技术体系。体获得新性状的技术体系。 2、植物基因工程的应用前景、植物基因工程的应用前景 改变植物的遗传性状。改变植物的遗传性状。 获得抗病、抗虫、抗除草剂等抗逆性状；获得抗病、抗虫、抗除草剂等抗逆性状； 改良农作物农艺性状，提高产品质量；改良农作物农艺性状，提高产品质量； 改变植物的育性和不亲合性。改变植物的育性和不亲合性。 作为一种生物反应器。作为一种生物反应器。 药用蛋白和植物次生代谢产物的生产；药用蛋白和植物次生代谢产物的生

3、产； 生产某些有机化合物。生产某些有机化合物。 植物基因功能研究。植物基因功能研究。 3、植物基因工程研究成果、植物基因工程研究成果 通过国家商品化生产或安全证书的有转基因耐贮通过国家商品化生产或安全证书的有转基因耐贮 藏番茄、转查尔酮合成酶基因矮牵牛、抗病毒甜藏番茄、转查尔酮合成酶基因矮牵牛、抗病毒甜 椒、抗病毒番茄、抗病毒辣椒、抗虫棉花等椒、抗病毒番茄、抗病毒辣椒、抗虫棉花等6 6种种 我国自主研制的转基因植物。我国自主研制的转基因植物。 转基因番茄转基因番茄 19941994年，美国政府批准年，美国政府批准 了他们研制成功抗干旱、了他们研制成功抗干旱、 早熟、保鲜的转基因番茄早熟、保鲜的

4、转基因番茄 商品化之后，我国也相继商品化之后，我国也相继 成功培育出优良品种的转成功培育出优良品种的转 基因番茄，以满足人们的基因番茄，以满足人们的 需求需求。 转基因甜椒转基因甜椒 甜椒在栽培的过程甜椒在栽培的过程 中，容易受病毒的中，容易受病毒的 感染。我国科学工感染。我国科学工 作者，采用转基因作者，采用转基因 技术，培育出抗病技术，培育出抗病 毒的甜椒。毒的甜椒。 转基因玉米转基因玉米 玉米是主要粮食之一，玉米是主要粮食之一， 又可以提炼油脂，也又可以提炼油脂，也 可以用作食品和工业可以用作食品和工业 的原料以及作饲料，的原料以及作饲料， 浑身是宝。人们称它浑身是宝。人们称它 是含金的

5、植物。如今是含金的植物。如今 培育出转基因玉米，培育出转基因玉米， 品质更好，产量更高。品质更好，产量更高。 我国科学工作我国科学工作 者，用转基因者，用转基因 技术，可以转技术，可以转 变矮牵牛花的变矮牵牛花的 花色，使矮牵花色，使矮牵 牛花的花色更牛花的花色更 加丰富多彩。加丰富多彩。 转基因牵牛花转基因牵牛花 转基因油菜转基因油菜 油菜是人们食用油的油菜是人们食用油的 主要来源之一。一般主要来源之一。一般 油菜籽的含油量约为油菜籽的含油量约为 4040左右。通过转基左右。通过转基 因技术，培育出来的因技术，培育出来的 油菜籽，可以大大地油菜籽，可以大大地 提高它的出油率。而提高它的出油率

6、。而 且油的纯度质量更好且油的纯度质量更好 转基因小麦转基因小麦 从植物体中分离出合从植物体中分离出合 成赖氨酸的基因，把成赖氨酸的基因，把 这基因转入小麦植株这基因转入小麦植株 中，培育出转基因小中，培育出转基因小 麦。用这种转基因小麦。用这种转基因小 麦制造出来的面粉，麦制造出来的面粉， 更适合用来烤面包，更适合用来烤面包， 而且面粉中赖氨酸含而且面粉中赖氨酸含 量高，这种面包的营量高，这种面包的营 养价值高。养价值高。 二、植物基因转化的方法二、植物基因转化的方法 原生质体介导法原生质体介导法 基因枪法基因枪法 根癌农杆菌介导法根癌农杆菌介导法 种质系统的基因转移种质系统的基因转移（花粉

7、管导入法）花粉管导入法） 1、原生质体介导法、原生质体介导法 以以原生质体原生质体为受体，借助于特定的化学或物为受体，借助于特定的化学或物 理手段将外源理手段将外源DNA直接导入植物细胞的方法。直接导入植物细胞的方法。 原生质体介导的基因转化是植物遗传转化研原生质体介导的基因转化是植物遗传转化研 究中最早建立的一个转化系统。包括究中最早建立的一个转化系统。包括5种方法：种方法： 聚乙二醇介导的基因转化聚乙二醇介导的基因转化 脂质体介导基因转化脂质体介导基因转化 电激法介导基因转化电激法介导基因转化 显微注射介导的基因转化显微注射介导的基因转化 激光微束介导的基因转化激光微束介导的基因转化 PE

8、G介导的基因转化介导的基因转化 利用化学试剂，如利用化学试剂，如聚乙二醇聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇聚乙烯醇 (PVA)、多聚多聚-L-鸟氨酸鸟氨酸(pLO)和和磷酸钙磷酸钙等，诱导原等，诱导原 生质体摄取外源生质体摄取外源DNA分子，进入原生质体的外源分子，进入原生质体的外源 DNA分子就有可能通过某种机制整合到基因组中，分子就有可能通过某种机制整合到基因组中， 完成遗传转化过程。完成遗传转化过程。 第一例成功的转基因烟草就使用该转第一例成功的转基因烟草就使用该转 化方法获得的。化方法获得的。 脂质体介导基因转化脂质体介导基因转化 利用脂类化学物质包裹外源利用脂类化学物质包裹外源DNA成球体

9、，通成球体，通 过植物原生质体的吞噬或融合作用把包含外源过植物原生质体的吞噬或融合作用把包含外源 DNA的脂质体转入受体细胞。的脂质体转入受体细胞。 特点：转化率高；操作繁琐；技术性更高。特点：转化率高；操作繁琐；技术性更高。 电激法介导基因转化电激法介导基因转化 利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电电 激穿孔激穿孔” ，形成可逆的瞬间通道，形成可逆的瞬间通道,从而促进外源从而促进外源 DNA进入原生质体。进入原生质体。 特点：转化率高；操作简便特点：转化率高；操作简便 ；特别适于瞬；特别适于瞬 时表达的研究；容易造成原生质体损伤。时表达的研究；容易造成原生

10、质体损伤。 显微注射介导的基因转化显微注射介导的基因转化 利用显微注射仪将外源利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体的细直接注入受体的细 胞质或细胞核，从而实现外源基因的转移。胞质或细胞核，从而实现外源基因的转移。 特点：方法简单、转化率高；适用于各种植物和特点：方法简单、转化率高；适用于各种植物和 材料，无局限性；对受体细胞无毒害材料，无局限性；对受体细胞无毒害。 激光微束介导的基因转化激光微束介导的基因转化 将激光引入光学显微镜聚焦成微米级的微束照将激光引入光学显微镜聚焦成微米级的微束照 射培养细胞，在细胞膜上形成能自我愈合的小孔，射培养细胞，在细胞膜上形成能自我愈合的小孔， 使加入细胞培

11、养基里的外源使加入细胞培养基里的外源DNA流入细胞，实现基流入细胞，实现基 因的转移。因的转移。 优点：操作简便；工作效率高；适应于各种动优点：操作简便；工作效率高；适应于各种动 植物；受体的类型广泛；用于细胞器的基因转化。植物；受体的类型广泛；用于细胞器的基因转化。 2、基因枪法、基因枪法(particle gun) 将外源将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在 高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或组织，微粒上高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或组织，微粒上 的外源的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上并得到表进入细胞后，整合到植物染色体上并得到

12、表 达，从而实现外源基因的转化。达，从而实现外源基因的转化。 根据基因枪的动力系统，分为根据基因枪的动力系统，分为3种类型种类型 火药爆炸力为加速动力火药爆炸力为加速动力，采用塑料子弹和阻挡板。，采用塑料子弹和阻挡板。 塑料子弹前端载放着塑料子弹前端载放着DNA包裹的钨包裹的钨/金粉。金粉。 高压气体作为动力高压气体作为动力，如氦气、氢气、氮气等。把载，如氦气、氢气、氮气等。把载 有有DNA的钨的钨/金粉铺洒在一张微粒载片上，在压缩空金粉铺洒在一张微粒载片上，在压缩空 气的冲击下，驱动载片，当载片受阻于金属筛网时，气的冲击下，驱动载片，当载片受阻于金属筛网时， 载有载有DNA的钨的钨/金粉继续

13、向下冲击射入细胞。金粉继续向下冲击射入细胞。 高压放电为驱动力高压放电为驱动力，可以无级调速，通过变化工作，可以无级调速，通过变化工作 电压，使载有电压，使载有DNA的钨的钨/金粉粒子能达到目的细胞层。金粉粒子能达到目的细胞层。 PDS-1000/He系统系统 基因枪的操作步骤基因枪的操作步骤 DNA微弹的制备：金粉或钨粉微弹的制备：金粉或钨粉50100mg、DNA、 CaCl2、PEG4000和亚精胺和亚精胺 靶外植体材料准备靶外植体材料准备 DNA微弹轰击微弹轰击 轰击后外植体的培养轰击后外植体的培养 转化率及其影响因素转化率及其影响因素 金属微粒的影响金属微粒的影响 DNA沉淀辅助剂的影

14、响沉淀辅助剂的影响 DNA的纯度及浓度对转化率的影响的纯度及浓度对转化率的影响 微弹速度的影响微弹速度的影响 a) 植物材料的内在因素的影响植物材料的内在因素的影响 3、根癌农杆菌介导法、根癌农杆菌介导法 植物冠瘿瘤植物的一种癌症植物冠瘿瘤植物的一种癌症 冠瘿瘤的起因：冠瘿瘤的起因：由根癌农杆菌由根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)属根属根 瘤菌科瘤菌科(Rhizobiaceat)对植物的侵染对植物的侵染 而引起而引起 冠瘿瘤的侵染过程：冠瘿瘤的侵染过程：细菌通过伤细菌通过伤 口进入植物，在基因水平上转化植口进入植物，在基因水平上转化植 物。细菌物。细菌DNA中的

15、编码基因中的编码基因在植物在植物 细胞中表达，刺激植物细胞不受控细胞中表达，刺激植物细胞不受控 制的分裂，形成瘤。制的分裂，形成瘤。 冠瘿瘤冠瘿瘤 Ti质粒质粒(Tumor inducing plasmid) Ti质粒质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共 价闭合环状价闭合环状DNA分子，其分子量为分子，其分子量为95156 106D， 约有约有200kb。 Ti质粒的类型质粒的类型： 根据冠瘿瘤合成的冠瘿碱种类不同分为：根据冠瘿瘤合成的冠瘿碱种类不同分为： 章鱼碱型章鱼碱型 (octopine) 胭脂碱型胭脂碱型 (nopaline) 农杆碱型农

16、杆碱型 (agropine) Ti质粒的基因结构质粒的基因结构：T-DNA区、区、Vir区、区、Con 区和区和Ori区共区共4个区段。个区段。 Ti质粒的遗传特性质粒的遗传特性 T-DNA区区 (transfer DNA region) TiTi质粒中的一部分质粒中的一部分DNADNA片段，进入寄主细胞并片段，进入寄主细胞并 插入基因组中，能够利用植物的酶系统进行插入基因组中，能够利用植物的酶系统进行 转录和翻译，其表达产物可诱发植物产生肿转录和翻译，其表达产物可诱发植物产生肿 瘤。瘤。 T-DNA区结构特征：区结构特征： 左右两端边界各有一个左右两端边界各有一个25bp长的正向重复序列长的

17、正向重复序列(Lb 和和Rb) ，具有高度保守性。，具有高度保守性。 右边界突变和缺失导致转移能力降低或丧失。右边界突变和缺失导致转移能力降低或丧失。 T-DNA以单拷贝或多拷贝的形式随机整合到植物以单拷贝或多拷贝的形式随机整合到植物 染色体染色体DNA上。上。 胭脂碱胭脂碱T-DNA (23kb) pTiC58 章鱼碱章鱼碱T-DNA (13.6kb) pTiAch5 NOS：胭脂碱合成 胭脂碱合成 酶基因酶基因 ocs：章鱼碱合章鱼碱合 成酶基因；成酶基因； tmr：根性肿瘤根性肿瘤 基因基因 tms：芽性肿瘤芽性肿瘤 基因；基因； tml：大肿瘤基因大肿瘤基因 Vir区区(毒性区毒性区)

18、 在在Ti质粒质粒T-DNA区的上游的一组基因。表达产物激活区的上游的一组基因。表达产物激活 T-DNA向植物细胞转移，使植物引发肿瘤。向植物细胞转移，使植物引发肿瘤。 Con区区 含有农杆菌之间接合转移有关的基因含有农杆菌之间接合转移有关的基因(tra) Ori区区(复制起始区复制起始区) 调控调控Ti质粒自我复制。质粒自我复制。 取代型取代型Ti质粒克隆载体质粒克隆载体 用用E.coli质粒克隆载体取代野生型质粒克隆载体取代野生型Ti质粒的全质粒的全 部或部分部或部分T-DNA核苷酸序列，构建的载体。核苷酸序列，构建的载体。 onc-Ti质粒克隆载体质粒克隆载体 T-DNA上上Onc基因基

19、因被取代；保留被取代；保留T-DNA的两端边界的两端边界 序列和序列和nos基因。基因。 onc+Ti质粒克隆载体质粒克隆载体 T-DNA上的部分序列被上的部分序列被pBR322所取代，仍保留所取代，仍保留Onc 基因。进入植物细胞后，可诱发冠瘿瘤，如基因。进入植物细胞后，可诱发冠瘿瘤，如 pGV3850和和pMPG1。 pGV3850从胭脂碱从胭脂碱Ti 质粒质粒pTiC58衍生而来衍生而来 含有含有T-DNA边缘区，以及边缘区，以及 除除T-DNA以外全部的以外全部的DNA 序列序列 临近右侧边缘区临近右侧边缘区(RB)编码胭编码胭 脂碱合成酶的脂碱合成酶的nos基因，供基因，供 作鉴定转

20、化细胞的记号作鉴定转化细胞的记号 缺失的缺失的T-DNA核心区由核心区由 pBR322序列取代序列取代 IQM1 pBI121-P35S:IQM1-Hm 35S35S启动子是植物基因工程中常用的组成型启动子启动子是植物基因工程中常用的组成型启动子 中间质粒克隆载体中间质粒克隆载体 T-DNA的部分序列插入大肠杆菌质粒克隆载体，承载的部分序列插入大肠杆菌质粒克隆载体，承载 外源基因后，须先在辅助质粒推动下进入农杆菌，再在外源基因后，须先在辅助质粒推动下进入农杆菌，再在 农杆菌介导下送入植物细胞。农杆菌介导下送入植物细胞。 共整合克隆载体系统共整合克隆载体系统 利用体内重组技术构建大型无毒的利用体

21、内重组技术构建大型无毒的Ti质粒重组体质粒重组体 双元克隆载体系统双元克隆载体系统 将带有外源目的基因的将带有外源目的基因的T-DNA和和Vir区，安区，安 置在不同的质粒载体上进行操作。置在不同的质粒载体上进行操作。 特点：由两个彼此相容的特点：由两个彼此相容的Ti质粒组成质粒组成 含有含有 Vir区的质粒；区的质粒；含有含有T-DNA区段的区段的DNA转转 移质粒移质粒 共共 整整 合合 克克 隆隆 载载 体体 系系 统统 双元双元Ti载体系统载体系统 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的分子机理质粒介导的基因转化的分子机理 农杆菌对受体的识别农杆菌对受体的识别 农杆菌附着到植物受

22、体细胞农杆菌附着到植物受体细胞 诱导启动毒性区基因表达诱导启动毒性区基因表达 类似接合孔复合体的合成和装配类似接合孔复合体的合成和装配 T-DNA的加工和转运的加工和转运 T-DNA的整合的整合 三、转化子细胞的筛选三、转化子细胞的筛选 1、选择基因：、选择基因：一类编码可使抗生素或除草剂失一类编码可使抗生素或除草剂失 活的蛋白酶基因。活的蛋白酶基因。 新霉素磷酸转移酶新霉素磷酸转移酶 (neomycine PT,NPT)基因基因 含卡那霉素的选择培养基上，携带含卡那霉素的选择培养基上，携带NPT基因的转化细基因的转化细 胞存活；非转化细胞致死。强选择标记，应用广泛，胞存活；非转化细胞致死。强

23、选择标记，应用广泛， 但假阳性率高。但假阳性率高。 潮霉素磷酸转移酶潮霉素磷酸转移酶(hygromycin PT ,HPT)基因基因 在含潮霉素的选择培养基上，携带在含潮霉素的选择培养基上，携带HPT基因的转化细胞基因的转化细胞 具有抗潮霉素的能力，能够存活；非转化细胞致死。具有抗潮霉素的能力，能够存活；非转化细胞致死。 庆大霉素抗性基因庆大霉素抗性基因(gentr) 膦丝菌素乙酰转移酶基因膦丝菌素乙酰转移酶基因(bar) 2、报告基因：、报告基因：是指其编码产物能够被快速测定、是指其编码产物能够被快速测定、 常用于判断外源基因是否成功的导入受体细胞，常用于判断外源基因是否成功的导入受体细胞，

24、 是否启动表达的一类特殊用途的基因。是否启动表达的一类特殊用途的基因。 _ _葡萄糖苷酸酶基因葡萄糖苷酸酶基因( (gusgus) ) GUS是一种水解酶，能催化某些特殊反应进行，通过对是一种水解酶，能催化某些特殊反应进行，通过对 反应产物的检测即可确定反应产物的检测即可确定Gus基因的表达。基因的表达。 荧光素酶荧光素酶(luciferase, LUC)基因基因 LUC是一种源于萤火虫的动物蛋白基因产物，能够催化是一种源于萤火虫的动物蛋白基因产物，能够催化 生物发光反应。生物发光反应。 四、转化体的鉴定与证实四、转化体的鉴定与证实 PCR检测外源基因的整合检测外源基因的整合 Southern杂交检测外源基因的整合杂交检测外源基因的整合 RT-PCR检测外源基因的表达检