免疫学实验指导.

1、免疫学实验指导生命科学与工程学院生物工程、生物技术、动物医学专业用冯玉萍分组 ：4人/组 ，实验用动物、器材以每组需要量设计班级 2006生物工程 、生物技术学生人数 ：65人/58人 。 分 16组/15组时间 2008年 3月 2008年 7月 两周一次 4学时。目录 实验一、免疫学实验动物的一般操作 实验二、实验动物免疫器官、免疫细胞观察 实验三、实验动物的采血方法、动物血清及红细胞的制备方法 实验四、淋巴细胞分离与 E 玫瑰花环形成试验 实验五、 IgG 的分离和纯化 实验六、玻片凝集试验 （ABO 血型鉴定 ） 实验七、环状沉淀试验 实验八、琼脂扩散试验（单向） 实验九、巨噬细胞吞噬

2、功能试验 实验十、白细胞吞噬试验21实验一、免疫学实验动物的一般操作实验原理 实验动物的基本操作是免疫学实验的基础 ,抗原对动物机体的免疫效果，通 过实验动物进行验证，因此必须掌握实验动物的一般操作技术。目的要求 1、实验材料的准备（棉球、注射器的准备与消毒）（演示）2、了解免疫学实验常用动物的生物学特性、用途及其健康要求。自学 3、学习实验动物的编号、抓取、固定和几种不同的注射途径方法。4、练习对小白鼠给药的几种不同途径的注射方法。5、练习小白鼠的取血方法。6、学习血涂片的制作及染色；观察动物血液中有形成分的形态结构特点。实验动物 小白鼠， 2 只/组，共需 18 20只。试剂 3%来苏儿或

3、 3%石炭酸 100150 ml/ 组；无菌生理盐水100150ml/组；磷酸盐缓冲液2050ml/组（带滴管、染 色用）。3 5%苦味酸2050ml/组（带滴管，编号用）；5%品红20ml50ml/组（带滴管，编号用）； 瑞特氏（wright s）染色液50ml/组（带滴管，染色用）； *抗凝剂一支器材 1ml 注射器及针头 2 支 /组； 碘酒棉球、酒精棉球、无菌干棉球各适量； 手术剪刀 2 把/组；镊子 2 把/组；载玻片、盖玻片各 6 片 /组； 毛细吸管 2 支、 50100ml 烧杯 1 个/组 显微镜 6 台 /组6 鼠笼 1 个 /组操作步骤 1、练习小白鼠抓取、编号、皮下注射

4、、皮内注射、腹腔注射的方法。（见免疫学实验 P9-13。2、练习小白鼠尾静脉取血法。（ P15）实验报告要求：1 、时间、地点、操作人、同组人、指导老师。2、实验原理、目的要求3、实验操作记录（实验步骤、结果）4、分析总结：依据实验原理、目的要求，分析总结实验是否成功，是否达 到实验目的？为什么？5、对实验动物编号有何实际意义，你对书中关于小白鼠的编号方法有何想 法？有无更简便、实用的方法？6、若给动物注射传染性材料应注意些什么？实验二、免疫器官与免疫细胞观察实验原理免疫器官、免疫细胞是动物免疫系统的主体。在胸腺、脾脏中有大量淋巴细 胞存在，在外周血液中有大量淋巴细胞和白细胞等免疫细胞存在，发

5、挥着免疫监视作用。目的要求1、练习血涂片的制作附图2-1血片制备方法2、学习小鼠颈椎脱臼致死的方法，观察小白鼠的解剖结构；3、学习脾脏、胸腺的触片制备与染色方法；观察小鼠脾脏触片、血液涂片 中的免疫细胞，并画图。方法与步骤1、练习血涂片的制作（3张/组）1）准备一张洁净玻片，取血1滴于玻片右侧，另取一光边玻片的一端，放在 血滴前方，并逐渐后移接触血滴，血液立即沿推片散开，然后将推片与载片保持 30 一 45度角,平稳地向前推动，至玻片另一端，载玻片上便留下一层血膜。良好 的血膜象舌头，头、体、尾鲜明，厚薄适宜、分布均匀，边缘整齐,两侧留有空隙。2）染色：A、瑞特氏（WrightFs）染色法：

6、.血涂片制成后可在空气中挥动，使迅速干燥，以免血细胞皱缩。选择良 好的血片，用特种玻璃铅笔画出两边界限（注意保留尾部，因体积大的细胞往往 在此出现），以防染液外溢。 在血膜上滴加几滴瑞氏染色液，左右晃动，使染液完全覆盖血膜，注意染 液不宜过多而溢出界限，亦不能过少而干燥。 1 2min后，滴加等量磷酸盐缓冲液或生理盐水， 2 3min后，可见表面 有金属光泽，即可用清水轻轻冲去染液，待血片自然干燥或用滤纸轻轻吸干。 在 正常的情况下，血膜外观染成粉红色。3） 镜检：先在低倍镜下检查血片，染色是否合格，血细胞分布是否均匀等， 然后换高倍镜或油镜观察，并绘图，指出淋巴细胞与白细胞、红细胞。如自己图

7、片不成功，则对教学片进行观察和绘图。结果：血液涂片瑞特氏染色法染色的结果：中性粒细胞 ：是白细胞中数量最多的细胞， 胞体大于红细胞， 细胞核蓝紫色， 呈分叶形，可分 25 叶。叶间有细丝相连；细胞浆为粉红色，其中充满褐灰色 的小颗粒。嗜酸性粒细胞 ：数量少，占白细胞总数的 0.53%。胞体较中性粒细胞大， 胞核蓝色，颗粒粉红色。嗜碱性粒细胞 ：细胞核蓝紫色，颗粒蓝色。 红细胞数量最大，边缘厚（浓染），中央薄（淡）。 淋巴细胞 细胞质天蓝色，细胞核几乎占据整个细胞。B、姬姆萨染色法： 用甲醇固定标本 10 分钟，或醋酸：甲醇 =1：3 的混合液固定 30 分钟。 用滴管吸取姬姆萨染色工作液布满材

8、料面，注意不要有气泡。 染色 10 15分钟后，用自来水冲洗，空气干燥，二甲苯透明5 分钟。 用光学树脂封片后观察。结果：血液涂片 姬姆萨染色法 染色的结果：有核细胞的细胞核染成紫红色或蓝紫 色，细胞浆染成粉红色。无核细胞染成：C、血液标本片观察结果：2、练习小白鼠脊椎脱臼处死法。或用乙醚麻醉致死。3、 仔细解剖小鼠，观察小鼠的内脏器官，找出脾脏、胸腺，分别做触片（3 张/组）并用瑞特氏（WrightFs）染色法或姬姆萨染色法染色、观察。4、观察标本片，绘图描述人、小鼠血液中的几种有形成分。 结果1、脾脏触片瑞特氏染色法染色的结果：2、脾脏触片姬姆萨染色法染色的结果：3、标本片观察结果：实验报

9、告要求：1、时间、地点、操作人、同组人、指导老师。2、实验原理、目的要求3、实验操作记录（实验步骤、结果）4、分析总结：依据实验原理、目的要求，分析总结实验是否成功，是否达 到实验目的？为什么？5、绘图描述：人、鼠血液涂片中的淋巴细胞、粒细胞、红细胞实验三、实验动物的采血方法、动物血清及红细胞的制备方法实验原理 抗原免疫动物后，其相应的抗体就会产生并存在于动物的体液中。血清是 体液的重要组成部分，存在大量抗体。学会了制备血清的方法，就学会了制备 抗血清的方法。红细胞是免疫学反应中常用的颗粒性抗原，也是可溶性抗原的载体及补体 结合反应中指示系统的组成成员。在许多免疫学检测中都要用到红细胞，因此，

10、 血清与红细胞的制备技术，是免疫学实验的基本技术。目的要求 1、学习鸡、兔的动脉、静脉及心脏等部位的无菌采血方法；2、学习动物血清、红细胞的制备方法；3、掌握离心机的使用方法。4、解剖鸡、兔，观察免疫器官。 实验动物 鸡、兔各 1 只/2组，共需鸡 5只、兔 5只。 试剂3%来苏儿或3%石炭酸50 100 ml/组； 无菌生理盐水150ml/组；分两瓶（100ml/瓶、50ml/瓶）500单位/ml的肝素溶液25ml/班。器材 10ml 注射器及针头 2 支 /组； 碘酒棉球、酒精棉球、无菌干棉球各适量； 50-100ml 烧杯 1 个/组； 手术刀、剪、镊子各 1 把 /组；50100ml、

11、带玻璃珠的无菌三角烧瓶1个/组（可用20ml链霉素瓶代 替）； 无菌试管及试管塞 6 套/组；离心管 2 支/组；（ 6）离心机 1 台 /6 组，共 3 台； 试管架 1 个 /组、恒温培养箱一个 /班、冰箱一个 /班。操作步骤 1、兔耳静脉采血（ P19）2、兔耳中央动脉采血（ P19）3、兔心脏采血：（ P18）4、鸡翼根静脉取血（ P19）5、鸡心脏取血（ P18）。6、离心法制备血清：取下注射器针头将抽得的血液以无菌操作注入无菌的离心管中，平衡离心 管，离心10 20分钟/2000 3000rpm。用毛细滴管吸出血清，将 获取的血清 分装于已灭菌的小瓶内 ，加盖并 用封口胶将瓶口封住

12、，贴上标签注明血清的名 称及制备日期，臵低温冰箱中保存备用。7、沉淀法制备血清： 取下注射器针头将抽得的血液以无菌操作注入无菌试管（或平皿）内，加盖臵37C温室内2小时，凝固后用无菌滴管沿试管（或平皿）边缘将血块与皿壁 脱离，然后放入48C冰箱中过夜，使血清充分析出。吸取血清分装于已灭菌的 小瓶内备用。8、动物血红细胞制备：(1) 无菌操作取静脉血，将血注入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，振摇数分钟以脱纤 维抗凝。(2)取适量的脱纤维血，用 25倍无菌生理盐水洗 2次，每次2000rpm，离心10分 钟，弃上清后用无菌生理盐水配成 20%的红细胞悬液，臵 4C冰箱保存备用。作业：实验报告1、简述无菌

13、采血应注意哪些事项？2、离心机操作中应注意哪些问题？3、血清制备中应注意哪些问题？4、红细胞制备中应注意哪些问题？ 备注：实验前请仔细阅读免疫学实验！实验四 血球凝集反应和交叉配血试验实验原理 红细胞等颗粒性抗原与血清中相应的抗体， 在适量电解质存在的条件下， 经 一定时间后，凝集成肉眼可见的凝集物。抗原抗体的这种反应，称为凝集反应。在人的ABO血型中，A型血的红细胞上有 A抗原，血清中有抗B抗原的抗 体；在B型血的红细胞上有B抗原，血清中有抗A抗原的抗体；故A型血的红 细胞与 B 型血的血清混合时，在有电解质存在的条件下就可能发生凝集；同样， B 型血的红细胞与 A 型血的血清混合，在有电解

14、质存在的条件下也可能发生凝 集；AB型血的红细胞上，既有 A抗原，也有B抗原，而其血清中既无抗 A抗 原的抗体，也无抗B抗原的抗体；而0型血的红细胞上既无 A抗原，也无B抗 原，而其血清中既有抗 A抗原的抗体，也有抗 B抗原的抗体，故AB型血的血 清与A型、B型、0型血的红细胞混合，均不会发生凝集，也就是说， AB型血 的人能接受A型、B型、0型血液的输血；而0型血的血清与A型、B型、AB 型血的红细胞混合，均可能发生凝集；既 0型血的人不能接受 A型、B型、AB 型血液的输血，但他却是万能输血者，其红细胞可以输给任何血型的人。兔、鸡是否也有相应的血型？尚不清楚。 本实验可自行设计， 在有生理

15、盐水 存在的条件下，利用不同组的兔与兔、鸡与鸡、鸡与兔的红细胞和血清的混合， 观察凝集现象和溶血现象，并分析、总结实验结果。目的要求 1、将实验三所制备的鸡、兔血清、红细胞分别进行交叉，自行设计，观察 鸡与鸡、兔与兔、鸡与兔之间血清与红细胞交互混合，产生的凝集现象和溶血 现象。2、尝试着利用抗原抗体反应的特异性对实验结果进行解释。试剂0.85%生理盐水，100ml/组；5ml注射器2支/组。器材 载玻片每人 1 张、小试管 4支/组，毛细滴管 2支/每组。 操作步骤 1、将制备好的鸡、兔红细胞用生理盐水稀释成 0.5%的混悬液。2、兔与兔(鸡与鸡)配血，观察血球凝集现象：取1#兔（鸡）血清1滴

16、于载玻片上，加入2#、3#兔（鸡）红细胞，用火柴 棒混匀，过1015分钟，观察，血球凝集现象。3、兔与鸡（鸡与兔）配血，观察血球凝集现象取1#、2#兔（鸡）血清1滴于载玻片上，加入1#、2#鸡（兔）红细胞，用 火柴棒混匀，过10T5分钟，观察，血球凝集现象。4、兔与兔（鸡与鸡）配血，观察溶血现象：取1#、2#兔（鸡）血清0.51ml,加入0.5%的1#、2#鸡（兔）红细胞，混 匀，静止过1520分钟，观察上清液是否溶血（变红），血球是否凝集？（沉 淀物边缘是否整齐）。5、记录结果女口：兔与兔（鸡与鸡）配血，观察血球凝集现象项目实验1实验21#兔血清1滴-1#兔红细胞-1滴2#兔血清-1滴2#兔

17、红细胞1滴实验结果凝集（或不凝集）凝集（或不凝集）如：兔与兔（鸡与鸡）配血，观察溶血现象项目实验1实验21#兔血清0.5ml-1#兔红细胞-0.5ml2#兔血清-0.5ml2#兔红细胞0.5ml实验结果凝集（或不凝集）凝集（或不凝集）溶血（或不溶血）溶血（或不溶血）6、总结、分析、讨论实验报告附、玻片凝集反应试验（ABO血型鉴定试验）目的要求1、掌握玻片凝集试验的操作方法，了解其特点和用途;2、学习玻片凝集试验结果的观察方法3、了解ABO血型鉴定的原理，掌握其鉴定方法靳准虑型血濱 felfr D Murtf试剂1、诊断用人血型抗A血清；2、诊断用人血型抗B血清；3、无菌生理盐水4、消毒液器材1

18、、凹玻片或载玻片6片/组，2、无菌刺血针、小试管、尖嘴滴管、毛细吸 管、牙签、酒精棉球、无菌干棉球、显微镜各 1个/人，每组6人；3、试管架、记号笔各1个/组。吸取诊断用人血型抗 用)。操作步骤(1) 用酒精棉球消毒被检者的指尖或耳垂，用无菌刺血针刺破皮肤，取血12滴放入盛有0.51ml生理盐水的小试管中，摇匀即成为1%2% 的红细胞悬液。取血后，用无菌干棉球压迫针眼止 血。(2) 取双孔凹玻片一张或载玻片一张，在 二孔(或二端)处标明A、B。用尖嘴滴管分别A和抗B血清，各加一滴于相应的孔内(注意两滴管切勿混(3) 用尖嘴滴管吸取待检红细胞悬液于 A、B血清中各加1滴。(注意勿使 滴管尖端和血

19、清接触)。(4) 分别用牙签将抗血清与红细胞悬液混匀(也可前后左右轻轻晃动载玻片 使其混匀，用牙签混匀时应分别用两端搅拌，切不可用同一端在 A、B两抗血清 中搅拌)O(5) 充分混匀后，臵室温于实验台上静臵1015分钟后观察有无凝集发生。如混合液由均匀混浊的红色逐渐变为透明，并出现大小不等的红色凝集块即为红细胞凝集；若混合液呈均匀分散混浊状，边缘整齐,则为不凝集。如观察不够 清楚，可臵显微镜下用低倍镜观察。血型判定可参照下图及表。红细胞凝成大块或有数个红细胞凝集在一起为 凝集。用抗血清鉴定血型的结果与判定血型抗A血清抗B血清A+B+AB+O+表示凝集，-表示不凝集作业与思考题1. 你的血型是何

20、型？你是如何判断的？2你能接受何种血型的血液？能输血给何种血型的人？为什么？衷20 k用杭曲清特宦血垫的拮果与判定血型抗清抗岂曲清H-*AH+tc二_ _-t+ h畫朮擬集.表示不睚集.2 2 用掠洛血希捞定血型的结嶷与判定标淮A取血沾标血H曜血常（内含日童集家）（内含欧此蛍累）3.根据下表中提供的凝集反应的结 果,请将血型检查结果填入表中：BAB标准A型血清标准B型血清待检者血型+一一一+一4.完成下表:血型红细胞中的 抗原血清中的抗体被凝集的 红细胞类型输血中能接受 的血型ABABO备注：实验前请仔细阅读免疫学实验P77-1095、如果要检测血清中血型抗体的效价，请你写出主要的操作过程实验

21、五、淋巴细胞的分离与 E玫瑰花环形成试验目的要求1、学习血液中免疫细胞的分离方法。2、学习E花环试验的操作方法。3、观察显微镜下E花环的形态。4、掌握花环计数的方法及其形成原理。5、了解检测Ea、Et花环的意义。材料与试剂人外周血：静脉采血24ml，注入盛有23滴肝素（500单位/ml）的青 霉素瓶中，摇匀。应在4小时内进行实验。Alsever，s保存液 绵羊红细胞（2周内）。 无菌及吸收过的小牛血清：将小牛血清臵56C水浴经30分钟灭活后，按每毫升小牛血清加入已洗涤过的压积绵羊红细胞0.1ml混匀，臵37C水浴中1小时，然后臵4C冰箱过夜。以2000rpm离心沉淀10分钟，取上清过滤除菌，

22、分装小瓶，低温保存备用。无钙、镁Hank s液； 淋巴细胞分离液，比重为1.0771.080。（上海试剂二厂生产，密度P（g/ml） 为1.0770.002,避光低温（4C）保存，有效期23年。）0.8%戊二醛，用0.43%NaCI溶液临用前配制。 瑞氏染色液或1%美蓝水溶液。器具水平式离心机、水浴箱、冰箱、离心管、吸管、试管、内放玻璃珠的三角烧 瓶、显微镜等。操作步骤1. 制备淋巴细胞悬液（1）取1m1淋巴细胞分离液加1ml肝素抗凝血，使血液轻轻覆盖在分离液上面， 并使血液与分离液之间保持清晰的界面。（2）立即臵水平式离心机中以 2000rpm离心20分钟。离心后分为四层，最上 层为血浆，中

23、间一层为分离液。上层和中层之间有一乳白色层含有大量淋巴细胞，小量大单核细胞。最下层为红细胞。（见图）（3）用尖嘴滴管小心地吸取淋巴细胞于一试管中，加入无Ca2+、Mg2+的Hank,s 液洗涤3次,每次以2000rpm离心10分钟沉淀淋巴细胞，末次洗涤后弃上清，仅留 约0.1ml液体制成淋巴细胞悬液。细胞计数,用Hank,s液配成5= 106/m!的细胞肝常抗疑血辭巴堀甩廿离懣血浆-阵巴期胞出单核轴胸一一廿离袱-茅曲桂口细胞虹43胞悬液淋巴细胞分离过程2.1% 绵羊红细胞悬液的制备取一定量阿氏液保存的绵羊血于离心管中，用无Ca2+、Mg2+的Harlk s液洗3次,末次洗涤后取压积的血球用上述

24、 Hank,s液配成1%悬液,细胞浓度约为2= 108细胞/ml。3. 活性T花环(Ea花环)的形成(1) 取淋巴细胞悬液0.1ml，加入小牛血清0.1ml和0.2ml1%的绵羊红细胞悬液混匀。(2) 于水平式离心机内以500800rpm离心5分钟，小心吸去上清液，留下约0.1ml液体, 立即沿管壁加入一滴 0.8%戊二醛溶液固定 23分钟,轻轻转动试管小心混匀。(3) 加入 12滴1%美蓝水溶液混匀 ,取一滴于载玻片上、 臵油镜下汁数 200个淋巴细 胞中形成花环的淋巴细 胞百分数。一般以淋巴细胞吸附三个以上绵羊红细胞者为 一个花环。4. 总 T 花环 (Et 花环)的形成(1) 取淋巴细胞

25、悬液0.1ml加入小牛血清0.1ml及0.2m11%的绵羊红细胞悬 液，混匀，臵37C水浴5分钟，其间摇动2次。(2) 500800rpm离心5分钟,臵4C冰箱24小时，吸去少许上清液，约留0.1ml 液体,沿管壁加入 0.8%戊二醛溶液一滴 ,固定 23分钟,轻旋试管以混匀 ,其余同 Ea 花环步骤。注意事项 1. 必须采用新鲜抗凝血来分离淋巴细胞 ,从取血到试验最多不超过 4小时。否 则,形成 E 花环的百分数会显著下降。2. 绵羊红细胞的质和量对花环形成有较大的影响。不新鲜的绵羊红细胞可使 花环形成显著减少。绵羊红细胞与淋巴细胞的比例以 100:1 为宜,比例过低 ,花环 形成明显降低

26、,反之则升高。3. pH值对花环的形成有影响。最适 pH为7.27.40。过高、过低的pH值可 使花环值下降。4. 在制片时需混匀花环悬液 ,悬浮时一定要轻旋试管 ,不可用滴管用力吹打或 摇动试管 ,以免形成的花环脱落。5. 镜检时有干片和湿片二种方法。湿片不能长期保存。干片是推片法 ,标本 片可长期保存 ,但推片时花环易脱落 ,花环形成细胞分布不均匀 ,推片尾部常高于 头部一倍以上。6. 花环形成时 ,加入蛋白成分可提高花环的稳定性 ,常用胎牛血清 (或小牛血 清)，但需先经56C30J分钟灭活，并用绵羊红细胞吸收，以除去嗜异性抗体，否则此 抗体可和绵羊红细胞起反应并吸附于 B细胞膜Fc受体

27、上，产生B细胞花环，从而 影响试验的准确性。作业与思考题 1. 用简明扼要的方式表明 Ea和Et花环形成的操作流程。2. 你的实验结果怎样 ?请分析试验成败的原因。3. Ea和Et花环形成时的主要区别是什么 ？4作E花环试验时，为何加入小牛血清？不用小牛血清用人血清行吗？加入的小牛血清为什 么要经56C 30分钟灭活，并用绵羊红细胞吸收？备注：实验前请仔细阅读免疫学实验 P179-183实验六、 IgG 的分离和纯化目的要求 1、学习动物血清中 IgG 的分离纯化方法；2、比较成年牛血清、新生牛血清 IgG 的含量；3、了解分离、纯化抗体的原理；4、熟练掌握离心机的使用方法。试剂 成年牛血清

28、20ml 、新生牛血清 20ml ； pH7.4 、 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液 250ml。 pH8.0、 0.005mol/L 磷酸缓冲液 250ml ； 饱和硫酸铵溶液 500ml ； 1%氯化钡 250ml 。器材 无菌 1ml、2ml 、5ml、10ml 吸管各 2 支 /组； 酒精棉球适量； 离心管 2 支 /组 离心机 1台/5组； 2-3 台/班试管架1个/组、记号笔1支/组、4C冰箱1个/班。操作步骤 1分别取成年牛血清、新生牛血清各2ml(X)于离心管中，加等量的pH7.4、 0.01mol/L,磷酸盐缓冲盐水或生理盐水，将血清稀释一倍，慢慢摇动避免形成泡 沫。2.

29、在冰浴中逐滴加入4ml(2X)饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，以防止形成团 块，减少沉淀。此时即有大量的 Y-球蛋白沉淀(主要是IgG)。3. 臵冰箱静臵30分钟或更长时间后，冷冻离心(30004000rpm,15分钟)，弃上清。沉淀用 2ml( X)0.01 mol/L 磷酸盐缓冲盐水溶解。4逐滴加入1ml (1/2 X)饱和硫酸铵边加边搅拌，使饱和度为33%,臵4C 冰箱 3060分钟,离心收集沉淀。同法重复 3、 4步骤 3 次,可得到较纯的 IgG。作业与思考题 实验报告1. 分离纯化免疫球蛋白为什么尽可能在低温条件下进行?所用溶液为何要先冷却?2. 常用的分离、纯化免疫球蛋白的方法主要有

30、哪几种 ?各自得到的纯度如何 ?3. 五类免疫球蛋白分离纯化的方法皆相同吗 ?4. 如果用血浆来分离纯化IgG,需不需要去除纤维蛋白原？5. 分离纯化 IgG 时,为什么硫酸皱的饱和度先调至 50%,然后调至 33%?加入硫 酸铵溶液时 ,为什么要一滴滴地加 ?6. 如果要提取IgA,从初乳中提取是否比从血清中提取合算 ？为什么？7. 比较成年牛血清与新生牛血清中 IgG 含量并分析之。P44-48备注：实验前请仔细阅读免疫学实验实验七、单向琼脂扩散试验目的要求 1、通过本试验，学习一种抗原定量的测定方法。2、了解沉淀环的直径与抗原或抗体浓度的关系。 材料与试剂 1、3%生理盐水琼脂；2、正常

31、人血清、已知 IgG 含量的人血清；3、羊抗人 IgG 抗血清；4、生理盐水；5、待测羊血清。器具1、载玻片 6 张 /组；2、打孔器、微量加样器、湿盒（盒内铺二层湿纱布）、操作步骤 1、溶化3%生理盐水琼脂，并臵56C水浴中保温。2、 稀释抗血清 :将羊抗人 IgG 抗血清按 1/2 效价用生理盐水稀释 （如效价为 1:60,则 稀释成1:30），分装于小试管，每管1.5ml，臵56C水浴保温（温度不能高于56C，且时间不 能过长 ）。3、.取上述56C水浴保温的琼脂和抗血清等量混合，小心倾注于臵水平台上 的载玻片上 （勿倒出玻片外 !）。（板上的抗血清终浓度是多少 ?）4、稀释参考血清 :

32、取参考血清一支 ,加入蒸馆水 0.5 时,完全溶解后用生理盐水 倍比稀释成1:101:160五种浓度,并算出IgG的相应含量（严g/ml）。如参考血清 IgG含量为11.66mg/ml。参考血清稀释度为1:10、1:20、1:40,则IgG相应含量为 1166 卩 g/ml、583 卩 g/ml、291.5 卩 g/ml。5. 将待测血清用生理盐水稀释成 1:40的浓度。6. 待琼脂凝固后按模板用打孔器打孔，孔径3mm,孔距10mm。孔中的琼脂 如未吸出 ,则用注射器针头将其挑出 ,务必将孔中的琼脂挑净且不可损坏孔缘。7. 加样:用微量加样器吸取各浓度的参考血清 ,按顺序加入各孔中 ,每孔加

33、入10卩l。每一浓度加二个孔。已稀释好的待测血清，每份标本也加二个孔，每孔 10 卩 l。8. 扩散：将加好样的琼脂板平放于湿盒内，臵 30C温箱或室温扩散2448 小时。9. 取出琼脂板 ,即可见清晰的乳白色沉淀环。测量各浓度沉淀环的直径。以两相同稀释度孔沉淀环直径的平均值为横坐标,相应孔中 IgG 的含量为纵坐标 ,在半对数坐标纸上绘出标准曲线。10. 待测血清标本中 IgG 的含量是根据标本孔中沉淀环直径 ,在标准曲线上 查得 IgG 含量乘以标本的稀释倍数 ,即为标本 IgG 含量。作业与思考题 备注：实验前请仔细阅读免疫学实验 P123-126 !1.在单向琼脂扩散试验中 ,为什么一

34、定要把板铺平 ?如何才能使板铺平呢 ?2. 在本试验中 ,加样后进行扩散时 ,为什么一定要把板放平 ?为什么要保持潮湿环境 ?3. 为什么水浴温度要控制在 56C?超过60C行不行？抗血清在56C水浴中放臵过长时 间对实验有无影响 ?4. 为什么抗体板中抗体浓度越小 ,沉淀环越大 ,灵敏度越高？实验八 双向琼脂免疫扩散试验实验原理将抗原和相应抗体分别加入同一凝胶板内的相邻小孔内，使两者互 相扩散，当扩散到两者浓度、比例合适的部位相遇时，就会形成抗原抗体复合物 的沉淀。呈现乳白色沉淀线。如果抗原抗体不相对应，贝U无沉淀线出现。故此试 验可用已知抗原检测未知抗体；也可用已知抗体检测未知抗原。如果加

35、于琼脂孔中的抗原、抗体，含有两种以上抗原、抗体系统时，由于各 种抗原的浓度、分子量及扩散系数不同以及各对抗原抗体形成沉淀时所需的最适 比例不同，扩散后变可形成多条沉淀线。每一条沉淀线代表一对抗原、抗体系统。 所以本实验可以用于分析、鉴定复杂的抗原物质成分，以及测定抗原或抗体的纯 度。根据沉淀线的形态和位置，可了解抗原、抗体的相对浓度和扩散速度。而扩 散速度与分子量成反比。因此也可间接了解抗原抗体的分子量大小。俛淀线吻合沉淀线相切标准抗1 含有与彳 有另外F沉淀纟A s A宕、A右浓度24 A邑二Ab |： Aj? Ab 扩敢率近似？ E.深与抗血;沆淀线相交浣淀线部分吻合圉11-4抗原性质分析

36、示意图 Alt待检抗Hi恣:标准抗原原和标准抗原性质相同+但含拭较低。3.抗体效价滴定用梅花型 孔.中间放抗原，周帼孔放不同稀 释度的相应抗体以岀现沉淀线的原不同亠（4）沉淀线部分吻合：待测抗戲高椿释倍数为该抗体的效价*见图 11-5*4-抗原或抗体纯度鉴定 如 操作步骤 1）溶解琼脂培养基，练习抗原、抗体双向扩散试验的载玻片铺板、打孔的方法。 每组选出一块两边均打好梅花孔的载玻片。梅花孔孔径 3mm孔距4mm2）加样：A 测定抗原效价： 在一组梅花孔中， 以上方为第一孔，顺时针方向分别为 2、3、4、5、6孔。加入 1：4、1：8、1：16、1：32、1：64稀释的抗原 10ul ；在 中间

37、孔加入抗体（ 1： 4 稀释） 10ul 。B、样品血清抗原检测：在另一组梅花孔中， 以上方为第一孔， 顺时针方向分别为 2、3、4、5、6 孔。 在 1、 4 孔中加入生理盐水，作为阴性对照； 2、 5孔中加入 1： 4稀释的抗 原做阳性对照； 3、 6孔中加入 1： 20稀释的待检血清各 10ul ；在中间孔加入抗 体（ 1： 4 稀释） 10ul 。3）扩散：将加好样的琼脂板平放于湿盒内，置 30C温箱或室温扩散2448小 时，观察、分析实验结果。作业：实验报告附：环状沉淀试验目的要求 1、了解环状沉淀试验的原理及用途2、通过沉淀素的效价测定，学习环状沉淀试验的操作方法及观察结果的 方法

38、。材料和试剂 1、人血清；2、兔抗人血清3、生理盐水。器具1沉淀管（2.53.0mm的内径，约30mm长）8支/组2、5ml 小试管 7支/组3、毛细吸管 2 支/组、吸管 2 支/组4、记号笔 1支/组5、沉淀管架1支/组，50-100ml烧杯1个/组。操作步骤1. 収小试背7支于试管架上并逬行编号匚2. 取1 ：25的人血清1ml用倍比林释法按下表稀释成各种浓 度。他 血清稲释度L：5fl 3： 100 1：200 1 400 1：$00 1 1600 1：32003取8支沉淀管于试管架上并编号。4用毛细吸管吸取1:2的兔抗人血清于各沉淀管底部，每管2滴5用另一毛细吸管吸取上面已稀释好的人

39、血清，按下表加入各管。沉淀管12345678兔抗人盹,M 1：2（滴）22 2222 2人低枠度1；50面Li：woraou 1=400J 6001：3 20U生毬盐用清恤人（篙222 2222 2加液时应从最高稀释度（第7管）加起，沿管壁徐徐加入，使两液面间形成一 明显界面，切勿使之相混，如界面不清时应重做。第8管加生理盐水以作对照。6. 于室温中静臵1530分钟后观察结果,观察二液面交界处有无乳白色沉 淀环出现。凡有乳白色沉淀环出现者记作（+）,无沉淀环者记作（-）。最高稀释度的 抗原与抗体交界面之间仍有乳白色沉淀者，该管的稀释度即为沉淀素的效价。作业与思考题1、将试验结果填入表中:试管1

40、23451 678抗原 稀释度1： 501： 1001： 2001： 4001： 8001:16001：3200生理 盐水结果沉淀素的效价是多少？2、简述环状沉淀试验的用途。3、试比较凝集反应与沉淀反应的异同。4、请设计一个实验用于鉴定血迹是人血还是动物血备注：实验前请仔细阅读免疫学实验P119-122实验九、巨噬细胞的体内吞噬试验目的要求1通过实验，了解巨噬细胞在非特异性免疫中的作用。2、观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象。3、掌握吞噬细胞百分数和吞噬指数的计算方法。实验动物小白鼠1只/组，共需10只/班试剂1%鸡红细胞50ml。6%可溶性淀粉肉汤50ml。 瑞特氏染色液50ml/组。无钙镁Ha

41、nk s液腹腔灌洗液。(5) PH7.07.2磷酸盐缓冲液50ml/组；1%戊二醛固定液50 ml/组。器材 无菌1ml、2ml注射器及针头各2支/组；酒精棉球适量；载玻片6片/组计数器2个/组操作步骤*小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能试验(1) 试验前三天，每只小白鼠腹腔内注射6%淀粉肉汤1m1。(2) 试验当天，给小白鼠注射1%鸡红细胞1ml。(3) 注射1%鸡红细胞后约30分钟，再于小白鼠腹腔注入灌洗液 1ml轻揉腹 边缘部。约20分钟后，用注射器吸取腹腔液少许，臵于洁净载玻片的一边。用另一 边缘光滑的载玻片将腹腔液推向另一边，制成薄推片,臵室温或37E温箱干燥。固定：用1%戊二醛固定液固定2

42、3分钟，用生理盐水冲洗，干燥。染色:用Wright氏染液染0.51分钟后，加双倍量pH7.07.2的磷酸盐缓 冲液混匀，并注意不要使玻片上的染料干,12分钟后以pB缓冲液冲去染液，以滤 纸吸干后镜检。在油镜下观察小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞现象，随机计数100个巨噬细胞(M )及其中吞噬有鸡血球(CRBC)的巨噬细胞的个数，即为吞噬百分数：吞噬百分率=100个M 中吞噬CRBC的M6数=100%100(M 数)再数此100个M中总共吞噬了多少个 CRBC,将此CRBC总数除以100, 得出每个M 吞噬CRBC的平均数，即为吞噬指数。作业与思考题1. 绘图表示所观察到的巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现

43、象。2. 计算巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数。3为什么要在小鼠腹腔内注射6%淀粉肉汤？4. 巨噬细胞除吞噬清除异物外，还有哪些功能？5. 请设计一个试验方案用以检测某一保健品对巨噬细胞吞噬功能的影响。备注：实验前请仔细阅读免疫学实验P49-53实验十、白细胞的体外吞噬试验目的要求 熟悉和掌握白细胞吞噬功能试验的方法和用途。【原理】 吞噬细胞主要包括血液中的中性粒细胞 ,巨噬细胞。当细胞或其它颗粒 性异物进入机体时，吞噬细胞通过：辨认异物；趋化和接触；胞饮或吞噬 消化排泄等步骤将其杀灭。【材料】1菌液：葡萄球菌菌液5= 109/ml，加热100C 15分钟杀死，4C保存备用。2.抗凝

44、人全血 （用 3.8%拘橡酸纳抗凝 ）。3. 甲醇。4. 快速染液甲液：伊红 Y1.00g无水磷酸氢二钠5.00g磷酸二氢钾6.25g蒸馏水500 ml乙液 : 美蓝0.80g天青 I0.50g无水磷酸氢二钠5.00g磷酸二氢钾6.25g蒸馏水500 ml将甲乙两液中的磷酸盐先用蒸馏水溶解 , 再分别加入染料 , 混合溶解后 ,静 臵 24 小时 , 即可应用。5. 小试管、载玻片、显微镜等。【方法】1. 取抗凝血 23滴于小试管内 ,用接种环取 23环葡萄球菌菌液与抗凝血充分 混匀，臵37C水箱孵育30分钟。2. 用接种环取出涂片 ,自然干燥。3. 甲醇固定：滴 2 滴甲醇液在标本上 ,待自然挥发至干。4. 快速染色法 : 将固定好的标本片放入甲液内染 3 秒钟, 水洗, 再放入乙液 内染 2