ELISA试验基本步骤及材料和试剂

1、E L I S A 基 本 步 骤 和 主 要 试 剂 、 材 料 注意：本步骤为间接 ELISA 步骤一 主要步骤1 包被 取所要包被的物质，提前设计好所需浓度，根据包被孔数计算所需包被物的量，用包被 液稀释至所需体积，分加至各孔中。包被条件：两种选择：一是将 ELISA板直接置4C过夜；也可以先置37C孵育2小时再 转入4C过夜。2 洗涤包被结束后弃掉包被液，用 PBST进行洗涤，方法为PBST加满每孔，静置5-10min，弃 掉洗液，重新加满，重复洗涤 3-5 次，最后拍干 ELISA 板等待下一步封闭。3 封闭常用 10%小牛血清，取第 2步的 ELISA 板加封闭液至每孔，体积至少为

2、所加包被液的两倍。封闭条件也有两种选择：直接置于 4C过夜，或者置于37E温育2-4h，具体何种条件不 同物质的 ELISA 可能不同。4 洗涤封闭结束的 ELISA 板进行洗涤，方法同步骤 2。最后拍干等待加入一抗。5 加入一抗一抗即为你要检测的物质，一般加之前需要稀释，具体稀释倍数不同实验 不同需要自己摸索。一抗样品一般用包被液稀释，稀释到所需浓度后加入到相应孔中。反应条件为37C孵育 2h。6 洗涤具体同步骤 4。7 加相应 HRP- 标记的商品化二抗加相应的商品化HRP-标记的二抗（如一抗为鼠源物质则对应加抗鼠二抗），一般也用封 闭液稀释，稀释倍数参考二抗说明书。将稀释好的二抗加入各孔

3、，37C反应1-1.5h。8 洗涤具体同步骤 4。9 显色常用OPD作为显色底物，但OPD致癌，也有用TMB作为底物，这里只介绍前者。显 色需要配置显色液，具体方法为：在步骤 8进行到一半使配置显色液，为10ml底物缓冲液加 0.015g OPD粉末（实际操作由于OPD有毒不方便称量故只需稍微加入一点即可），等待 0 PD完全溶解。待步骤8完成后取150ul 3%过氧化氢溶液加入之前配置的10ml溶液中混匀， 立即将此显色液分加至 ELISA各孔中。然后将ELISA板置于37C反应约10min。10 终止将 ELISA 板取出，每孔加终止液 （2mol/L 硫酸溶液）终止反应，立即到酶标仪上读

4、数 （ O PD 为底物是读数波长为 490nm， TMB 为底物时波长为 450nm）。二 材料、试剂1 ELISA 板专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为 8X12的96孔式，需要 购买。常用聚苯乙烯和聚氯乙烯材料。注意：聚苯乙烯材料目前只有进口，特点是孔大，加 满约300ul，此时实验中所加各试剂（包被液、一抗、二抗、显色液、终止液等）均为 100ul 体积。而聚氯乙烯多为国产，孔较小，加满约200ul，此时各试剂只需加50ul体积即可。2 各试剂配制1）包被液（PH6.3的碳酸盐缓冲液）无水 Na2CO3 0.1696gNaHCO30.2856gSW100m

5、l完全溶解至4C, 一周内使用2）PBST 配方NaCl8.0gNa2HPO4.12H2O 2.9gKCl0.2gKH2PO40.24gTW-200.5mlSW1000ml3）底物缓冲液Na2HPO43.682g柠檬酸1.02gDW200ml不需灭菌，4C保存4) 3% H2O230%H2O2100mlSW900ml5）显色剂底物缓冲剂10ml3%H2O2150ulOPD15mg其中 H2O2最后加6）终止液浓硫酸： SW = 1:8浓硫酸缓慢加入到 SW 中，并搅拌散热三 注意事项1 包被所谓37C反应，一般取一个37C的水浴锅，在水面放一较大泡沫板，将 ELISA板置于泡 沫板上即可，其余步骤的37 E反应操作同此；整个 ELISA 过程中所有需要较长时间等待的步骤（包被、封闭、加一抗孵育、加二抗孵 育）均需要将 ELISA 包起来再放入冰箱或水浴锅中，一般可直接用一次性EP 手套套起来即可。2 洗涤最常规的洗涤步骤是洗涤3次，每次间隔5min，具体实验可能会微调，洗涤次数可以 3- 6 次不等，间隔 5-10min 不等；每次洗涤后要将 ELISA 板尽可能拍干后在进行下一步操作，尤其是每个洗涤步骤的最后 一次洗涤要尽可能拍干，拍干可在纱布、吸水纸上进行，也可以购买洗板机。3 显色配制显色液时 3%过氧化氢一定要最后加入