培养基验收作业指导书删减版

1、培养基质量控制作业指导书1、目的： 为加强我微生物实验室的工作管理， 保证实验室的检测质量， 特制定此作业 指导书；2、范围： 本规范适用于实验室微生物检测中所使用培养基的质量控制 。3、职责：3.1 检验人员：按照本规程规对培养基使用前及使用过程中进行质量控制， 确保培养基符合相关标准的要求。3.2 科室负责人：负责指导、监督检验人员对培养基进行质量控制。4、控制措施：41 培养基的购置和验收4.1.1 培养基的购置 试剂管理员在接到批准的采购信息后，从合格供应商中选择厂商采购，同时要求 厂商提供每批培养基的批号、使用前的 pH值、储藏信息、有效期、性能评价记录（包 括测试菌株、技术数据清单

2、、质控证书及必要的安全危害数据） 。4.1.2 培 养基 的验收 购买培养基到货后，由试剂管理员和微生物检测人员共同核对生产企业提供的资料、培养基名称、 规格数量、 外观特征、 批号、保质期是否符合要求。 同时应 填写“培 养基验收检查记录单” 验收符合要求后，交由检测人员接受保管，填写培养基入库 记录和建立试剂台帐。42 培养基的储存 干粉培养基应保存在阴凉干燥处，要避免阳光直射；开瓶后的干粉培养基易吸湿， 应注意防潮并在有效期或 6 个月内用完。应每月对储存中的培养基进行常规检查，如 容器密闭性复查、首次开封日期、内容物的感官检查，如果培养基发生结块、颜色异 常和其他变质迹象就不能再使用。

3、 开封的脱水培养基， 每次使用前应对其质量进行 检查，通过粉末的流动性、均匀性、结块情况和色泽变化等判断培养基的质量 变化。若发现培养基受潮或物理性状发生明显改变则不应再使用。 即用性培养基 按照产品标识要求进行储存。43 培养基的使用4.3.1 配制培养基用水和玻璃器皿培养基制备用水应使用电阻率不小于 30万Q cm的蒸馏水或与其同质的水，每周检 测电阻率，每三个月检测一次重金属离子含量。 制备培养基所用的玻璃器皿（如吸 管、试管、烧杯等）新的玻璃器皿（首次使用）和再次使用的玻璃器皿按规定 方法洗涤、干燥4.3.2 称量 称量时要用专用的角匙，避免交叉污染而影响检验结果；干粉培养基易吸潮，如

4、房间环境湿度较大时，应提高称量速度，完毕后及时盖紧瓶盖。4.3.3 复水复水时应注意以下事项：a）不得用铜锅或铁锅，以防有离子混入培养基中，影响微生物的生长；b）容器的大小需大于复水后培养基总体积的 2倍以上，避免在加热溶解过程中， 培养基溢出；c）加热培 养基 时一定要进行搅拌，特别是琼脂类培 养基；d）为避免烧焦和沸腾溢出，对于少量的培养基最好使用沸水浴进行加热；e）含有琼脂粉的培养基，在加热溶解之前可以浸泡数分钟；f ）对于琼脂类培养基进行再融化时应使用沸水浴或流动蒸汽进行加热， 最多只能 加热两次，第二次再融化后仍未用完的培养基应弃去；g）烧糊的培养基营养物质被破坏，并可产生有毒物质，

5、如发现焦化，或未溶解均 匀前培养基有溢出，该培养基即不能使用，应重新制备。4.3.4 灭菌培养基采用高压蒸汽灭菌（湿热灭菌），通常是 121C 15mi n,含糖或特殊培 养基，按照国家标准或生产商提供的说明灭菌。已配制好的培养基必须在15分钟内灭菌，避免微生物生长繁殖而消耗养分，改变培养基的酸碱度。为避免高温破坏培养基的营养成分，降低琼脂的凝胶强度，必须严格控制灭菌温度和时间，不可重复灭菌。4.3.5 pH 测定 在初次使用每批培养基时，均需随同检测配制一个测试培养基，在灭菌或消毒后应在25C温度下采用精密PH试纸测试PH值，并判断是否符合要求；使用过程中，如 果需要调整培养基的pH,应用1

6、mol/LNaOH或Imol/LHCL调整，注意不可反复调 pH, 否则会影响培养基的渗透压。4.3.6 配制好的培养基标识和保存 灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度，避免长时间保存在灭菌锅内，造成过度灭菌，影响培养基的营养成分或选择性效果。同时 填写配制记录。内容：名称、 配制量、配方（比） 、操作中的重要参数（时间、压力、温度） 、配制日期、配 制者、截止使用日期。在每个已灭菌的培养基容器外做好标记，注明名称、配 制日期、使用期限和配制人。培养基保存注意事项：1） 环境条件：各种培养基均应在洁净的普通冰箱内保存，以2-8 C左右为宜，不得冻结。2）保存时限 : 基础培养基应在 30 天内

7、用完。鉴别培养基应在 21 天内用完。 选择性分离鉴别培养基制成平板后当日用完 ,置保鲜膜 （袋 ）密闭保存期限可延长 至一周。 从外单位购买的培养基保存时限按照产品标注的时限执行 .44 培养基批号的的管理培养基的批号由 6位阿拉伯数字组成，批号为年、月、日，各取 2 位，年份取后 2 位，月和日不足 2 位时，分别在数字前加 0，表明是本日配制的批号。如2004年6 月4日配制的培养基，批号为 040604。4.5 质量检查购置的同一批次培养基其质量检查应能通过无菌检查（制备好的培养基经 30 35C培养48小时，真菌培养基经2025C培养72小时候后，应无菌生长）、新 购的不同批次的商品

8、化培养基在使用前应进行培养基性能测试， 经检查合格的 该批次培养基方准许使用，否则不准使用，做好检查记录。 。成品培养培养基的 质量控制应包括物理指标和微生物指标的测试，根据测试结果及时填写“实验 室培养基 质量控制性能测试记录及评估报告4.5 培 养基 的性能测试 新购的不同批次的商品化培养基在使用前应进行培养基性能测试， 包括物理 指标和微生物指标的测试，根据测试结果及时填写“实验室培养基 质量控制性 能测试记录及评估报告 ，菌株的选择参考 SN/T 1538.2-2007 培养基制备指南 第 2 部分：培养基性能测试实用指南。451 物理指标控制1）测试20C25C的pH值2）琼脂层厚度

9、；色泽；透明度和（或）是否存在肉眼可见杂质； 452 微生物污染的控制从每批制备好的培养基中选取至少一个 （或1%平板或试管，置于35-37 C 或按特定标准中规定的温度培养 48h应无菌生长，真菌培养基经2025C培养 72 小时候后，应无菌生长 。453 微生物学指标控制 可根据要求选用定量方法、半定量方法或定性方法（详见表 1-表）对培养 基性能进行测试，具体操作方法如下：（ 1 ）生长率 将适量测试菌株的工作培养物接种至固体、半固体和液体培养基中，每种 培养基上菌株的生长率应达规定的最低限值。1 ）定量方法生长率Pr的计算：PR = N s/NoNs：从一个或多个待测培养基平板上得到的

10、菌落总数。M：从一个或多个规定的参考培养基平板上获得的菌落总数（该菌落总数应 100cfu ）。要求：非选择性培养基上目标菌的生长率最低应为 0.7 ，该类培养基应易于 目标菌生长； 选择性培养基上目标菌的生长率最低应为0.1 ；每平板（或每试管）的接种水平为10CFA100CFU2） 半定量方法 半定量方法采用生态测量技术在平板上划线，平板板连续划线区域得分的 总和即为生长指数 G, G值不应超过标准规定的允许范围。3）定性方法定性方法采用划线法观察。 选择性将浓度为104CFU/mL- 106CFU/mL的非目标菌工作菌株悬浮液接种至选择培养基和参考培养基中,培养基的选择性应达到规定值。

11、定量方法选择因子 SF：SF = D O - D SDO：能在参考培养基上生长至少 10个菌落的最高稀释度DS:能在测试培养基上显示生长的最高稀释度要求：非目标菌在选择性培养基上的 SF 至少为 2 ；半定量和定量法中,非 目标菌应部分或全部被抑制。 生理生化特性（选择性和特异性）规定培养基的基本特性,使用一套适当的测试菌株对培养基上的目标菌的 生理生化特性（菌落形态、大小等）和非目标菌的被抑制程度进行测试。（ 2）性能评价和结果解释 按照规定得到的所有测试菌株的性能均符合规定,则该批培养基品质优良； 若只有物理指标和微生物指标符合规定,则该批培养基可被接收。表 1 计数用选择性培养基培养基用

12、途培养条 件测试菌株参考培伞甘 养基控制 方法判定标 准特征反应Baird-ParkerS生长率37 C24-48h金黄色葡萄球 菌ATCC6538/25923TSA疋里Pr 0.5黑色/灰色菌落，周围为 一混浊带，其外有透明带选择性37 C 48h大肠杆菌ATCC25922/8739定性全部抑 制特异性37 C24-48h表皮匍萄球困ATCC12228定性黑色/灰色菌落，周围为 一混浊带，其外无透明带MYPS生长率30 C24-48h腊样芽胞杆菌ATCC11778TSA疋里Pr 0.7具沉淀带的粉色菌落选择性37 C 48h大肠杆菌ATCC25922定性全部抑 制特异性37 C 48h枯草芽

13、胞杆菌ATCC6633定性不具沉淀带的粉色菌落培养基用途培养条 件测试菌株参考培伞甘 养基控制 方法判定标 准特征反应VRBG 结晶紫中 性红胆 盐葡萄 糖琼脂）S生长率37 C 24h大肠杆菌ATCC25922/8739鼠伤寒沙门菌ATCC14028TSA疋里Pr 0.5带有或不带沉淀带的粉红色或红色菌落选择性37 C 20h粪链球菌ATCC29212/19433定性全部抑 制VRB（紫红胆汁 乳糖）S生长率30 C 20h大肠杆菌ATCC25922/8739.TSA疋里Pr 0.5带有或不带沉淀带的淡紫色菌落选择性30 C 20h粪链球菌ATCC29212/19433定性全部抑 制特异性3

14、0 C 20h铜绿假单胞菌ATCC27853定性-无色至浅棕色菌落CT-SMA（改良 山梨醇 麦康凯 琼脂）S生长率C37 C 24h大肠杆菌0157:H7ATCC43894/43895TSA疋里Pr 0.5透明菌落，表面淡黄棕 色，菌落直径约1mm选择性37 C 24h金黄色葡萄球 菌ATCC6538/25923定性全部抑 制特异性37 C 24h大肠杆菌ATCC11775/25922定性粉色菌落BGBLB（煌绿 乳糖胆 盐肉汤）L生长率30 C24-48h大肠杆菌ATCC25922/873 9弗氏柠檬酸杆 菌ATCC25922/8739TSA半定量浊度2+,导管1/3产气产气并浑浊选择性粪

15、链球菌ATCC29212/19433定性不生长EC L生长率44 C24 48h大肠杆菌ATCC25922半定量浊度2+, 导气管1/3产气产气并浑浊选择性44 C24 48h铜绿假单胞菌ATCC27853定性不生长EC-MUGLS-MUGL/生长率44 C24 48h大肠杆菌ATCC25922半定量浊度2+, 导气管1/3产气产气并浑浊，产生荧光选择性44 C24 48h铜绿假单胞菌ATCC27853定性不生长乳糖胆 盐发酵 培养生长率37 C 24h大肠杆菌ATCC25922半定量导气管1/3产气产气并变黄色鼠伤寒沙门菌表2 计数用非选择性培养基培养 基用途培养条 件测试菌株4参考培伞甘

16、养基控制方法判定标 准特征反应PCA（平 板计 数琼 脂）S生长 率30 C72h大肠杆菌ATCC25922/8739TSA疋量Pr 0.7金黄色葡萄 球菌ATCC6538枯草芽孢杆 菌 ATCC6633表3选择性增菌培养基培养 基用途培养条 件测试菌株控制方 法判定标准特征反应EE L生长率37 C24h大肠杆菌ATCC25922/8739、/ 宀 半疋里VRBGh10CFU粉红至红色 菌落，有或没 有沉淀带鼠伤寒沙门菌 ATCC14028选择性粪肠球菌ATCC29212全部抑制RVS L生长率41.5 C24h鼠伤寒沙门菌 ATCC14028、/ 宀 半疋里XLD或其他选择性培 养基上10

17、CFU肠炎沙门氏菌 ATCC13076铜绿假单胞菌 ATCC27853选择性41.5 C24h大肠杆菌ATCC25922、才 半疋里TSA上全抑制粪链球菌ATCC29212TSA上V10CFUSC（亚硒酸 盐胱 氨酸）L生长率37 C24h鼠伤寒沙门菌 ATCC14028、/ 宀 半疋里XLD或其他选择性培 养基上10CFU不同培养基 上菌落特征 不同（见标 准）+大肠杆菌ATCC25922+铜绿假单胞菌 ATCC27853选择性37 C24h大肠杆菌ATCC25922、/ 宀 半疋里TSA上V10CFU粪链球菌ATCC29212TTB（ 四硫 磺酸 钠煌 绿增 菌液）L生长率37 C24h鼠

18、伤寒沙门菌 ATCC14028 伤寒沙门菌CMCC50071、/ 宀 半疋里XLD或其他选择性培 养基上10CFU不同培养基 上菌落特征 不同（见标 准）选择性37 C24h大肠杆菌ATCC25922TSA上V10CFU碱性 蛋白 胨水L生长率37 C24h霍乱弧菌CMCC16109 副溶血性弧 菌 CMCC2000-、/ 宀 半疋里TCBS或其他选择性培养基上10CFU不同培养基 上菌落特征 不同（见标 准）选择性37 C24h大肠杆菌ATCC25922/8739福氏志贺氏菌 CMCC51572TSA上V10CFU7.5%氯化 钠肉 汤L生长率37 C24h金黄色葡萄 球菌ATCC6538、

19、/ 宀 半疋里B-P平板或其他培养 基上10CFU不同培养基 上菌落特征 不同（见标 准）表4非选择性增菌培养基培养基用途培养条 件测试菌株控制方 法判定标准特征反应BHI生长 率37 C24h金黄色葡萄球菌 ATCC6538定性浊度12蛋白胨 盐L稀释2025 C 45min大肠杆菌ATCC25922疋里+/-50%菌落数/至（+/-50% 原始菌落数金黄色葡萄球菌 ATCC25923表4非选择性增菌培养基（续）培养基用途培养条 件测试菌株控制方 法判定标准特征反应乳糖蛋 白胨肉 汤L生长 率37 C24h大肠杆菌ATCC25922定性导气管1/3产气选择 性37 C24h鼠伤寒沙门菌ATC

20、C14028定性SCDLP液体培伞甘 养基L生长 率37 C24h铜绿假单胞菌ATCC27853定性浊度12大肠杆菌ATCC25922金黄色葡萄球菌 ATCC6538液体沙 氏培养 基L生长 率26 C 5天白色念珠菌CMCC98001定性浊度12真菌培伞甘 养基L生长 率26 C 5天白色念珠菌CMCC98001定性浊度12表5选择性分离培养基培养基用途培养条 件测试菌株控制方 法判定标准特征反应亚硫酸 酸铋琼 脂(BSS生长率37C 48h鼠伤寒沙门菌ATCC14028定性良好生长(2)菌落呈黑色，有金属光泽福氏志贺氏困CMCC51572菌落呈棕色选择性大肠杆菌ATCC25922/8739

21、全部或部 分抑制(0 1)无典型菌落粪链球菌ATCC29212/19433全部抑制(0)-XLD S生长率37C 24h鼠伤寒沙门菌ATCC14028定性良好生长(2)菌落呈黑色福氏志贺氏困CMCC51573菌落呈无色选择性大肠杆菌ATCC25922/8739全部或部 分抑制(0 1)无典型菌落粪链球菌ATCC29212/19433全部抑制(0)-血琼脂 平板S生长率37 C24 48h金黄色葡萄球 菌ATCC6538/25923定性良好生长B溶血，透明溶血 环粪链球菌ATCC29212定性良好生长a溶血，草绿色溶 血环TCBSS生长率37 C24 48h霍乱弧菌CMCC16109定性良好生长

22、困洛较大，呈黄色副溶血性弧菌CMCC20001定性良好生长困洛较大，呈绿色4号琼脂JSJ生长率37 C24 48h霍乱弧菌CMCC16109定性良好生长困洛较大、扁平透 明、湿润、中心带有黑色非01群霍乱弧菌 CMCC17045定性良好生长菌洛较大、扁平透 明、湿润、中心带 有黑色选择性37 C 24h大肠杆菌ATCC25922/8739定性全部或部 分抑制（0 1）表5 选择性分离培养基（续）培养基用途培养条 件测试菌株控制方 法判定标 准特征反应伊红美 兰琼脂S生长率37 C 24h大肠杆菌ATCC25922/8739定性良好生 长菌落紫黑色带金属光泽鼠伤寒沙门菌ATCC14028定性良好生 长菌落灰白色半透明福氏志贺