复发性口腔溃疡口腔微生态的研究

1、复发性口腔溃疡口腔微生态的研究 摘要 相关的文献研究表明，在慢性胃癌病患者口腔牙菌斑、唾液中以及胃内能同事检测出幽门螺旋菌（ Helicobacter pylori,HP ）, 而伴有 HP感染的复发性口腔溃疡（ recurrent oral ulcer,ROU ）患者的消化道疾病的发病率也明显上升，提示口腔为 Hp 重要的聚集地之一， Hp 感染与 ROU发病之间可能存在一定的内在联系。结合既往史的相关证候研究提示的脾胃湿热证为Hp相关疾病发生过程中邪气最盛、邪正交争最剧烈的阶段，及Hp感染率较高之观点，初步提出: 临床 ROU反复发作的原因部分可能是缘于湿热粘滞及致病隐匿、渐进和缠绵的特征

2、以及 Hp 感染：脾胃受损，云华失调，湿热内藴，熏蒸口舌可能是 ROU缠绵难愈的关键病机之一，脾胃湿热、 Hp 感染与 ROU发病存在一定的内在联系。口腔中 Hp感染的相关研究的真实情况，有关脾胃湿热、 Hp感染与 ROU发病关系的探讨应引起必要的重视。【论文主要内容】：研究背景、目的和意义复发性口腔溃疡 (Recurrent Oral Ulcer,ROU), 又称“复发性口疮”、“复发性阿弗他溃疡” (Recurrent Aphthous Ulcer,RAU) 或“复发性阿弗他口炎” (Recurrent Aphthous Stomatitis,RAS), 是专指一类原因不明 , 具有周期性

3、反复发作但又具自限性的局限性口腔粘膜溃疡性损伤。该病是口腔粘膜病中最常见的溃疡类疾病 , 患病率高达 20%左右 , 居口腔粘膜病首位。复发性口腔溃疡发病时病变部疼痛剧烈 , 对患者工作与生活造成重要影响。 临床尚无明确有效的治疗方法。因此 ,ROU的病因及发病机制研究对进一步的临床治疗研究具有重要作用。本病病因至今不清 , 多方面的病因研究表明 ,ROU 的发生发展可能与多种因素有关。国内外文献已报道的病因方面的研究包括免疫学异常 , 病毒、细菌感染 , 微量元素、精神神经因素、 遗传因素影响及微循环障碍等 , 但尚无确切定论。 正常人体的口腔、肠道、呼吸道、泌尿生殖道等 , 均定植一定数量

4、的细菌 , 它们与宿主在长期进化过程中形成了一个能独立进行物质、 能量交流的动态平衡的微生态系统。定居于口腔中的菌群称为口腔正常菌群 , 它与宿主呈共栖的关系 , 他们彼此之间保持着动态平衡 , 对宿主起着有益和有害的双重作用。口腔中的细菌 , 在正常情况下对宿主有多种有益的生理作用 : 如抵抗外来致病菌、 产生多种营养物质、 促进免疫应答、产生过氧化物歧化酶 (SOD)、清除自由基 (O_2-) 及抗肿瘤等作用。一旦微生态平衡遭到破坏 , 发生菌群失调 , 上述生理作用发生改变 , 对宿主可能造成损伤。有学者提出 ROU的发生发展可能与多因素相互作用有关。多方面的病因研究表明,ROU 的发生

5、发展可能与多种因素有关。口腔内环境与这些因素有着密切的关系。那么 ,ROU的发生发展是否与口腔的微生态相关呢 ?ROU患者口腔微生态是否发生了变化 ?又是哪些方面发生变化 ?本研究将从口腔菌群变化及口腔菌群构成的角度, 探讨复发性口腔溃疡是否与口腔微生态变化有关 , 为口腔溃疡的防治探索新的依据。材料和方法一、 唾液菌群涂片观察收集临床唾液标本共 62 例。将其分为溃疡组、愈合组及正常对照组三组。溃疡组为临床确诊并处于溃疡期的20 例 ROU患者 , 其中男性 6 例, 女性 14 例 , 平均年龄 24.7 3.13 岁; 愈合组为临床确诊并处于愈合期的 21 例 ROU患者 , 其中男性

6、9 例, 女性 12 例 , 平均年龄 25.9 6.67 岁;对照组为无 ROU病史的 21 位健康成年人 , 其中男性 9 例, 女性 12 例, 平均年龄 23.3 2.27 岁。所有受试者均符合以下纳入标准 : 所有受检查者取样前 1 周内未服用任何抗生素、铋剂、 抗酸剂及 H_2受体拮抗剂 ,1 月内未服用类固醇药物或非类固醇类抗炎药 , 如阿司匹林等 ; 无其他系统疾病 ; 无其他口腔黏膜病 : 无中、重度牙周病。方法 : 唾液标本直接涂片 , 革兰氏染色 , 在显微镜 10 100 油镜下 , 选取分布均匀的 5 个视野 , 分别计数各视野下细菌中革兰氏阳性球菌 ( 简称 G+c

7、)、革兰氏阴性球菌 ( 简称 G-c) 、革兰氏阳性杆菌 ( 简称 G+b)、革兰氏阴性杆菌 ( 简称 G-b)所占的构成比 , 然后求其均值。分析了不同菌群间的比值及构成比的变化。统计学分析 : 用 SPSS13.0 统计学软件 , 对不同组别四类细菌的构成比及不同菌群间的比值采用单因素方差分析 (One-way ANOVA),采用 Dunnett T3法进行两两比较 , 以 P 0.05 为差异有统计学意义。二、复发性口腔溃疡口腔唾液中链球菌、韦荣氏菌及奈瑟氏菌的定量分析收集符合纳入标准的临床标本 , 共 95 例。纳入标准参考第一章。将其分为溃疡组、愈合组及正常对照组三组。溃疡组为临床确

8、诊并处于溃疡期的 39 例 ROU患者 , 其中男性 13 例 , 女性 26 例, 平均年龄 26.3 7.76 岁 ; 愈合组为临床确诊并处于愈合期的 35 例 ROU患者 , 其中男性 11 例 , 女性 24 例, 平均年龄 25.3 5.47 岁; 对照组为无 ROU病史的 21 位健康成年人 , 其中男性 9 例 , 女性12 例, 平均年龄 23.3 2.27 岁。方法 : 用引物设计软件 Primerprimer 5.0 设计三种常见口腔细菌 ( 链球菌、韦荣氏菌及奈瑟氏菌 )16S rRNA 基因扩增引物 , 并验证其特异性 ; 采用改良 CTAB/NaCl法提取细菌标本DN

9、A;通过实时荧光定量PCR检测链球菌、韦荣氏菌及奈瑟氏菌三种常见口腔细菌的含量。统计学分析 : 用 SPSS13.0统计学软件 , 对不同组别三种细菌的含量采用单向方差分析(One-way ANOVA),采用 Dunnett T3 法进行两两比较 , 以 P0.05 为差异有统计学意义。三、基于细菌16S rRNA基因分析的复发性口腔溃疡口腔细菌构成差异分析分别收集符合纳入标准的唾液标本 30 例, 纳入标准参考第一章。将其分为溃疡组、愈合组及正常对照组三组 , 每组 10 例。溃疡组为临床确诊并处于溃疡期的 ROU患者 ; 愈合组为临床确诊并处于愈合期的 ROU患者 ; 对照组为无 ROU病

10、史的健康成年人。方法 : 采用改良CTAB/NaCl法提取细菌标本 DNA,并且制备成混合标本。 用细菌 16S rRNA通用引物扩增混合标本 , 琼脂糖凝胶电泳 , 用 AlphaEaseFCStand Alone 软件行凝胶图像分析。选择回收纯化差异较明显的条带 , 测定片段序列并在 GenBank中比对 , 分析差异条带的种属源性。实验结果一、唾液菌群涂片观察溃疡组、 愈合组及对照组 G+c 构成比分别为 :45.16 6.99 、 43.38 6.92 及 42.96 4.69;G+b 构成比分别为:3.95 3.12 、3.04 1.38 及 2.65 1.71;G-b 构成比分别为

11、 :4.94 2.43 、3.79 2.16 及 4.35 2.96 。溃疡组、 愈合组及对照组 G+c、G+b及 G-b 构成比差异无统计学意义 (P=0.499 、P=0.160、P=0.352) 。溃疡组、愈合组及对照组G-c 构成比分别为 :45.94 5.42 、49.79 6.22 及 50.09 4.65; 三组间 G-c 构成比差异具有显著性 (P=0.032); 溃疡组 G-c 构成比较愈合组及对照组分别下降了3.85 及4.15 个百分点。溃疡组、愈合组及对照组球菌构成比均在 90%以上 , 三组总球菌的构成比分别为 :91.10 4.83 、93.17 2.57 及 93

12、.05 4.38; 总杆菌的构成比分别为:8.89 4.83 、6.83 2.57 及 7.00 4.37 。溃疡组、愈合组及对照组总球菌及总杆菌构成比差异均无统计学意义 (P=0.193 、P=0.201) 。溃疡组、愈合组及对照组 G+c/G-c 比值分别为 :1.00 0.26 、0.90 0.26 及 0.87 0.16;G+b/G-b 比值分别为 :0.83 0.45 、1.13 1.01 及 0.64 0.30;G+c/G+b 比值分别为 :17.5113.55 、18.08 11.02 及 24.20 15.93;G-c/G-b 比值分别为 :12.23 7.14 、 17.77

13、 12.10 及 15.34 7.90 。三组间 G+c/G-c、G+c/G+b及 G-c/G-b 差异均无统计学意义 (P=0.140 、 P=0.224 、 P=0.172),G+b/G-b 在三组间存在差异,P=0.063 。溃疡组、愈合组及对照组 G+c/(G+c+G+b)构成比分别为 :0.92 0.07 、0.93 0.03 、0.94 0.04;G+b/(G+c+G+b)构成比分别为 :0.08 0.07 、0.07 0.03 、0.06 0.04;G-c/(G-c+G-b) 构成比分别为 :0.900.04 、0.93 0.04 、0.92 0.05;G-b/(G-c+G-b)

14、 构成比分别为 :0.10 0.04、0.07 0.04 、0.08 0.05;G+c/(G+c+G-c) 构成比分别为 :0.49 0.06 、0.470.07 、0.46 0.04;G-c/(G+c+G-c)构 成比 分别 为 :0.51 0.06 、 0.53 0.07 、 0.54 0.04;G+b/(G+b+G-b) 构 成比 分别 为 :0.43 0.11 、 0.46 0.18 、 0.37 0.10;G-b/(G+b+G-b) 构成比分别为 :0.57 0.11 、0.54 0.18 、0.63 0.10 。三 组 间G+c/(G+c+G+b) 、 G+b/(G+c+G+b)

15、、 G-c/(G-c+G-b)、G-b/(G-c+G-b) 、G+c/(G+c+G-c)、G-c/(G+c+G-c) 、G+b/(G+b+G-b)、G-b/(G+b+G-b) 构成比差异均无统计学意义(P=0.302 、 P=0.302、 P=0.162、P=0.162、P=0.166、P=0.166、P=0.117、P=0.117) 。溃疡组、愈合组及对照组 G+/G-比值分别为 :0.99 0.25 、0.90 0.26 、0.85 0.16;Gc/Gb比值分别为 :13.85 8.53 、15.73 6.60 、17.85 9.88 。三组间 G+/G-、Gc/Gb差异均无统计学意义(P

16、=0.130 、 P=0.323) 。二、复发性口腔溃疡口腔唾液中链球菌、韦荣氏菌及奈瑟氏菌的定量分析溃疡组链球菌及韦荣氏菌含量的对数值分别为7.30 0.89和8.29 0.77,均显著低于对照组(8.150.55和 8.93 0.76,P 0.01),链球菌及韦荣氏菌含量分别较对照组降低了66%和 86%;溃疡组与愈合组间链球菌及韦荣氏菌的含量的对数值差异均无统计学意义(P=0.64 、P=0.17); 愈合组链球菌含量的对数值为7.51 0.81,显著低于对照组(8.150.55,P0.01),菌量较对照组降低67%,愈合组与对照组间韦荣氏菌含量的对数值差异统计结果P=0.056;奈瑟氏

17、菌含量的对数值在三组间的差异均无统计学意义(P=0.921) 。三、基于细菌 16S rRNA基因分析的复发性口腔溃疡口腔细菌构成差异分析在200-800bp 区间 , 于溃疡组、愈合组及对照组均稳定识别出3 条碱基数分别为230bp、400bp 及 770bp 左右的三条条带。溃疡组、愈合组及对照组三条条带灰度值的百分比有差异。在溃疡组、愈合组及对照组条带组成方面存在差异, 各组在不同位置均有条带缺失现象。 条带综合波形图也反映了溃疡组、愈合组及对照组在条带含量构成方面存在差异。选择回收纯化片段暂命名为1 号, 片段大小约为 180bp。测序结果通过生物信息学分析。1 号 blast比对结果示 1 号差异条带 70%与 GenBank中 BacteroidesvulqatusATCC 8482同源 , 匹配率 74%。结论 1、溃疡组、愈合组及对照组唾液菌群以球菌为主 , 溃疡组革兰氏阴性球菌构成比减少, 表明复发性口腔溃疡唾液菌群构成发生了变化。2、复发性口腔溃疡患者唾液中链球菌、 韦荣氏菌含量发生了减少性变化 , 提示构成口腔微生态的重要球菌菌群链球菌和韦荣氏菌含量的改变与复发性口腔溃疡的发生发展有关。 3、细菌 16S rRNA 基因扩增琼脂糖电泳及图像分析结果表明, 复发性口腔溃疡患者口腔细菌构成与健康成人的