HDV核酶研究近况

1、hdv核酶研究近况国外医学分子生物学分册1999年第21卷第5朔1一lfhdv核酶研究近况于乐成毛青综述顾长海李奇芬审阅_,.,_.一第三军医大学西南医院全军传染病中心(重庆,400038)了7摘要hdv核酶为hdv双滚环复制所必需,最小序列约85枝苷酸(n)左右,呈独特的假结样结掏,其结构和功能的关系已得到深入探索反式hdv核酶可能会成为一种新型有效的抗病毒药物键词hdv;核酶;结构和功能;应用丁衔韵研关键词核酶;结构和功能;应用ji竹田0】/一-一j丁型肝炎病毒(hdv)基因组为单负股环状rna,通过双滚环机制(doublerollingcirclemechanism)进行复制.该过程必须

2、经过病毒前体rna的自我催化裂解,即必须经过基因组核酶(genomeribozyme,grz)和抗基因组核酶(antigenomeribozyme.ag.rz,即复制中间体)的自裂.这一过程与一些植物致病病毒rna复制特点相似.hdv复制过程中rna的延伸,由宿主细胞rna聚合酶ii催化;自裂产物连接成环状,可能由宿主细胞rna连接酶催化”.1hdv核酶的自裂位点及最小序列1988年,sharmeen等用b物延伸法证明ag.rz的自裂位点在c904g903之间.不久.kuo等报道grz的自裂位点在u688g689之间.grz36100(自裂位点端和3端分别含36nt和1.0nt)活性较高.后来

3、.perrotta等通过体外试验发现g.rzl84和ag.rzl84(j端分别为u和c)能保持较高自裂活性,其序列分别对应于hdv基因组第688772nt和抗基因组第904820nt,提示hdv核酶的最小序列约85lit左右.g.rzl一82和ag.rzl一79虽能充分自*国家自然科学基金资助课题裂,但速率大大减慢.thill等将g.rzi84的5端延长至5nt,去除3端第jl68nt,得到g.rz566(g.rz71)仍能自裂,但同等条件下速率明显下降.2hdv核酶切割反应的机理及产物虽然.hdv核酶的结构与锤头状,发夹状核酶等明显不同,但催化反应发生的机理相似.都是转酯化反应.由自裂位点3

4、端的2-oh或氧原子对自裂位点处的磷原子实施亲核攻击,产物是23环化磷酸二酯和5一oh.倘缺乏2一oh或自裂位点5端为一脱氧核苷酸,则不能发生自裂.3体外hdv核酶切割反应的条件体外hdv核酶切割反应的条件为:mg_等二价金属阳离子为切割反应所必需.其矶理之一可能是中和核酶rna结构间的阴性斥力.使易于折叠成活性结构.ca,mn可替代mg,有的研究甚至观察到ca增加反式切割的效率远高于mgis,v.sr”_,ca,ba,co,pb,zn对某些诱变株的自裂有较弱的辅助作用一般在65c范围内随温度升高核酶活性增加.温度过高则因破坏hdv核酶的二级结构而使其丧失活性.有的研究观察到hdv核酶裂国外医

5、学分子生物学分册1999年第2l卷第j期解底物的速率对数在ph46范围内呈线性上升,而另有研究发现某些hdv核酶的切割速率在ph59.1范围内并无明显变化,但大多数研究均提示ph7.07.5时核酶活性最高.变性剂:g魁-cb2-:5ol群cjq/一g1i:i4hdv核酶的结构模型及其结构域g,rz和ag.rz二级结构相似,但与锤头状核酶,发夹状核酶及链孢属vs核酶不同.迄今主要提出3种模型,即假结样结街(pseudoknorstructure),斧头样结构(axheadstructure),三叶草形结构(cloverleafstructure)等模型.诱变分析,光交联,化学修饰等研究证实假结样

6、结构(附图)最为可能,可划分为9个结构域仅含lnt足可发生自裂,该nt可为u,c,a,但不能为ge3.4.2stem皿lee等.将g.rzl066此延长2倍,不妨碍核酶折叠+但能增加核酶对甲酰胺的抵抗性,使活性有所增强+而减少lbp就会明显降低自裂活性此区的碱基配对所形成的双螺旋堆集结构主要起稳定核酶活性的作用,不参与构成活性中心,其序列有较大灵活性4.3stemnl由3bp构成,5侧与stemi51侧共轴,3侧与stemi相邻.破坏其碱基配对或改变其序列均会导致活性下降+某些序列甚至完全无活性.所以此区结构和序列均很重要.4.4l3.与stem共同构成一个发夹环结构(hairpinloops

7、tructure).g.rz和ag.rz此区序列基本相同,富含嘧啶,唯g.rz多1个u27.l3有较高的序列特异性+可能参与构或活性中心其5端,特别是czllz4附近区域可能靠近裂解位点的磷原子以发挥催化作用.4.5stem和l4两者共同构成另一个发夹环结构体外试验证明此区可减至4bp而对活性影响不大.但稳定的stm结构确实有利于活性提高,尤其是其根部的cg配对起着连接儿/4和j4/2的桥梁作用4.6j1/2连接stem【和stemi,对体外自裂反应意义不大,设计反式核酶时可被切断或删去但ag.rz此区的8nt较保守,可能与核酶活性调节有关.4.7jl/4连接stem【与stem,其中的3个g

8、对核酶活性发挥很重要,若g38/40被a,c,u取代,则核酶活性明显下降.此区的g40/国外医学分子生物学分册l999年第21卷第5期42与位于j4/2区的g74/75的同型配对可使核酶结构扭曲,分别使c75/76靠近切割位点4.8j4/2连接stemn与stemi.对此区中g74/75,c75/76,a77/78,a78/79的碱基修饰显着降低核酶活性,c75/76的改变会导致核酶活性完全丧失光交联研究也显示ag.rz的c76靠近切割位点.因此c75/76很可能直接参与了催化作用.4.9应用x线衍射技术发现g.rzj1/区的g38g39可与l3区的c22,c21形成短双链区p1.1.从而使g

9、.rz呈复杂的巢式双假结样(nesteddoublepseudoknot)高级结构.多种方法研究显示:l3,j1/4,j4/2可能共同参与构成催化中心.进一步研究尚发现:若在两类hdv核酶间互换l3和j4/2+则活性均下降;但若只互换jl/4,则活性均有不同程度升高”5反式hdv核酶的设计及意义核酶的自裂是一种分子内切割反应.称为顺式切割(ciscleavage),核酶对底物的分子间切割则称为反式切割(transcleavage).hdv核酶是迄今发现的唯一可通过病毒自然感染而进入哺乳动物细胞中的核酶.所以研究其反式作用的重大意义在于利用它可能优于其它核酶的抗哺乳动物致病病毒作用.branch

10、等曾以斧头型结构为基础.从相应cdna上分别转录出相当于”酶和”底物”的rna分子,在适当条件下将两者混合,确实出现了”酶对”底物”的反式切割.假结样结构最接近实际结构,以它为基础的反式作用体系可分为3类:”底物”和”酶”通过stemi的碱基配对结合,”底物”相当于stemi5侧序列;”底物”和”酶”通过stem口,stem的碱基配对结合,酶由stem3侧,j4/2,stem3侧组成;”底国外医学分子生物学分册1999年第2l卷第5期物”和”酶通过stemi,stem,stem的碱基配对结合,”酶”由steml5侧,stem,l3,stemi3侧,j1/4及stemiv5侧构成,如lai等设计

11、的rna73/rna37(底物/酶)体系口,1个rna37分子可切割多个rna73分子,显示了”酶”的特点.后两类体系固核酶”对底物”序列要求过严,几无应用意义.第一类体系中+底物”与”酶”结合只需7nt,且在一定程度上可改变stemi3侧序列以适应底物序列+因此具有用来切割异源rna分子的潜在价值.6hdv核酶活性的调节目前对hdv核酶活性的调节有这样几点认识:基于hdvrna分子内约7o碱基互补的事实,lazinski等0认为互补序列的某些部分可充当”衰减子(attenuator)”的角色,通过碱基配对,使核酶及时失活丁型肝炎病毒抗原(hdvag)虽非hdv核酶自裂所必需,但确能加快自裂和

12、拼接反应1.razas等1”发现未感染细胞内存在一种hdvag类似物,能影响hdvrna复制,并具有和hdvag相互作用的潜在能力.新近perrotta等通过体外试验发现ag.rz的第8689nt(5,gcca3)可与j1/z区的第1013nt(5uggc3)形成一双螺旋区p2a,对ag.rz具有na依赖性调节活性:低浓度na(3mmol/l以下)时可显着抑制ag.rz活性,但若先用高浓度na一(100mmol/l以上)与ag.rz适当温育后再加入mg,则使切割活性明显升高;hdvag对hdv桉酶活性的调节可能类似这一机制.应当指出,加强对临床分离株序列变异的研究+可更多了解hdv桉酶在体内的

13、结构和功能变化+获取悻外实验研究所不能获取的重要信息,两者结合起来,对深入了解hdv核酶结构,性质,功能具有重要意义.参考文献laimm.annurevbiochem,1995;64:259sharmeenleta1.jvjroi,1988;62?2674kuomypa1.jvirol,1988;62:4439perrottaateta1.nature,1991350:434beenmdeta1.eurjbiochem,1997;247:741puttarajuemeta1.nucleicacidsres一1993:214253sakamototeta1.jbioehemtokyo,1997l

14、21:11238fauzihela1.nucleicacidsres,1997;25:31249leecbeta1.biochemistry,1996;35:1230310duhameijeta1.nucleicacidsres,1996:24:391111jengksela1.nucleicacidsres,1996;70:240312perrottaatela1.nucleicacldsres.1996:24:131413perrotlaateta1.biochemistry,199231:1614bravoca1.nucleicacidsres,1996;24:135115beenmdeta1.rna,19g5;1:106l16ferredamareara1.nature,1998,395:56717wadkinstsela1.nucleicacidsres,1997;25:408518branchada1.procnatiacadscjusa,1991;88:1016319kawakamijeta1.febsie(t,19