耐药结核病的产生与实验室诊断(6.21)

1、耐药结核病的产生耐药结核病的产生 与实验室诊断与实验室诊断 2014年年6月月21日日 耐药结核病产生耐药结核病产生 几个与耐药相关的概念几个与耐药相关的概念 原发耐药原发耐药 获得（继发）性耐药获得（继发）性耐药 自然耐药自然耐药 交叉耐药交叉耐药 初始耐药初始耐药 单耐药单耐药 多耐药多耐药 耐多药耐多药 广泛耐药广泛耐药 几个与耐药相关的概念几个与耐药相关的概念 原发耐药：以前未接受过抗结核药物治疗而发生原发耐药：以前未接受过抗结核药物治疗而发生 的耐药。大多是受到耐药病人的传染而获得的。的耐药。大多是受到耐药病人的传染而获得的。 获得（继发）性耐药：原来对抗结核药敏感的病获得（继发）性

2、耐药：原来对抗结核药敏感的病 例在治疗过程中发生的耐药。一般是治疗不当所例在治疗过程中发生的耐药。一般是治疗不当所 致。致。 初始耐药：原发耐药和不能肯定的获得性耐药的初始耐药：原发耐药和不能肯定的获得性耐药的 总称，经临床核实无法证明病人以往未曾接受过总称，经临床核实无法证明病人以往未曾接受过 治疗治疗 几个与耐药相关的概念几个与耐药相关的概念 自然耐药：是野生株中存在的耐药菌，在无药物存在的条自然耐药：是野生株中存在的耐药菌，在无药物存在的条 件下自然对抗结核药物产生的耐药。自然耐药菌可因结核件下自然对抗结核药物产生的耐药。自然耐药菌可因结核 病治疗用药不当、剂量不足、疗程不充分等选择性的

3、生长病治疗用药不当、剂量不足、疗程不充分等选择性的生长 发育，最终形成继发耐药菌。发育，最终形成继发耐药菌。 交叉耐药：结核菌对一种药物耐药的同时对其他药物也产交叉耐药：结核菌对一种药物耐药的同时对其他药物也产 生耐药。可以是两种或多种药物间的交叉。生耐药。可以是两种或多种药物间的交叉。1314th1314th与与 1312th1312th完全交叉耐药；氨基糖甙类单向交叉耐药：耐完全交叉耐药；氨基糖甙类单向交叉耐药：耐smsm 对对kmkm、akak敏感，耐敏感，耐kmkm对对akak、cpmcpm敏感；氟喹诺酮类药敏感；氟喹诺酮类药 物间完全交叉耐药，但对其他类无交叉耐药；环丝氨酸和物间完全

4、交叉耐药，但对其他类无交叉耐药；环丝氨酸和 特立齐酮完全交叉耐药，但对其他类无交叉耐药。特立齐酮完全交叉耐药，但对其他类无交叉耐药。 几个与耐药相关的概念几个与耐药相关的概念 单耐药：结核分枝杆菌对一种抗结核药物耐药单耐药：结核分枝杆菌对一种抗结核药物耐药 多耐药：结核分枝杆菌对不包括同时耐多耐药：结核分枝杆菌对不包括同时耐r r、h h在内在内 的一种以上的抗结核药物耐药的一种以上的抗结核药物耐药 耐多药：结核分枝杆菌至少同时对耐多药：结核分枝杆菌至少同时对r r、h h耐药耐药 广泛耐药广泛耐药( (严重耐多药）：结核分枝杆菌对严重耐多药）：结核分枝杆菌对r r、h h 耐药，同时对任何氟

5、喹诺酮类药物耐药，以及至耐药，同时对任何氟喹诺酮类药物耐药，以及至 少对一种二线抗结核注射剂（少对一种二线抗结核注射剂（cscs、kmkm、akak）耐）耐 药药 耐药结核病产生的原因耐药结核病产生的原因 细菌学、临床及规划的原因，本质是人为造成的细菌学、临床及规划的原因，本质是人为造成的 结果结果 微生物学观点，耐药性是基因突变引起药物对突微生物学观点，耐药性是基因突变引起药物对突 变菌效力降低造成的，是由于敏感菌株被抗结核变菌效力降低造成的，是由于敏感菌株被抗结核 药物杀死所诱发的某些菌群选择性耐药突变的结药物杀死所诱发的某些菌群选择性耐药突变的结 果果 临床及管理方面，不足够或不恰当的治

6、疗导致患临床及管理方面，不足够或不恰当的治疗导致患 者体内耐药突变菌成为优势菌者体内耐药突变菌成为优势菌 耐药结核病产生的原因耐药结核病产生的原因 细菌学原因：结核分枝杆菌在生长过程中可以自细菌学原因：结核分枝杆菌在生长过程中可以自 发、独立的发生抗结核药物耐药的自然突变，但发、独立的发生抗结核药物耐药的自然突变，但 野生型菌株中突变率低，耐药突变更低，在特定野生型菌株中突变率低，耐药突变更低，在特定 的野生型中的野生型中 耐异烟肼的突变耐异烟肼的突变3.5x103.5x10-6 -6 耐利福平的突变耐利福平的突变1.2x101.2x10-8 -8 耐乙胺丁醇的突变耐乙胺丁醇的突变3.1x10

7、3.1x10-5 -5 耐链霉素的突变耐链霉素的突变3.8x103.8x10-6 -6 野生型中对一种以上药物耐药很少见，是两率的野生型中对一种以上药物耐药很少见，是两率的 积积 耐药结核病产生的原因耐药结核病产生的原因 治疗和管理原因：治疗和管理不合理性是造成耐治疗和管理原因：治疗和管理不合理性是造成耐 药结核病最重要和最直接的原因，不合理性包括：药结核病最重要和最直接的原因，不合理性包括： 结核病防治规划组织执行不到位，没有按国家指结核病防治规划组织执行不到位，没有按国家指 南要求开展结核病防治工作南要求开展结核病防治工作 没有可靠的耐药结核病规划管理指南没有可靠的耐药结核病规划管理指南

8、没有足够培训没有足够培训 缺乏对治疗的监测缺乏对治疗的监测 耐药结核病产生的原因耐药结核病产生的原因 药物联合不合理、不恰当药物联合不合理、不恰当 用药剂量不足，服药方法不当用药剂量不足，服药方法不当 疗程不足或间断用药疗程不足或间断用药 对失败和复发的病例未做深入的分析和给予恰当对失败和复发的病例未做深入的分析和给予恰当 的处理的处理 对患者的治疗缺乏管理或管理不善对患者的治疗缺乏管理或管理不善 耐药结核病产生的原因耐药结核病产生的原因 其他原因：其他原因： 患者的依从性差患者的依从性差 患者对结核病知识的了解不足患者对结核病知识的了解不足 抗结核药物供应不足，种类不全，质量不佳，不抗结核药

9、物供应不足，种类不全，质量不佳，不 良反应重，生物利用度低等直接影响治疗效果良反应重，生物利用度低等直接影响治疗效果 经费不足，患者经济困难是造成间断、不规则用经费不足，患者经济困难是造成间断、不规则用 药的重要原因药的重要原因 新药研制的缓慢新药研制的缓慢 结核分枝杆菌耐药机制结核分枝杆菌耐药机制 目前对结核分支杆菌耐药机制研究很多，但仍然还没完全目前对结核分支杆菌耐药机制研究很多，但仍然还没完全 搞清楚，现在主要有以下搞清楚，现在主要有以下3 3种观点种观点 细胞壁结构与组成发生变化，使细胞壁通透性发生改变，细胞壁结构与组成发生变化，使细胞壁通透性发生改变， 药物通透性降低，产生降解或灭活

10、酶类，改变了药物作用药物通透性降低，产生降解或灭活酶类，改变了药物作用 靶位靶位 结核分支杆菌中存在活跃的药物外排泵系统，将菌体内药结核分支杆菌中存在活跃的药物外排泵系统，将菌体内药 物泵出，使胞内药物浓度不能有效抑制或杀死细菌，从而物泵出，使胞内药物浓度不能有效抑制或杀死细菌，从而 产生耐药性产生耐药性 分子机制：结核分枝杆菌基因组上编码药物标靶的基因或分子机制：结核分枝杆菌基因组上编码药物标靶的基因或 与药物活性有关的酶基因突变，使药物失效产生耐药与药物活性有关的酶基因突变，使药物失效产生耐药 耐药结核病的流行耐药结核病的流行 耐药结核病是全球结核病控制工作的严峻挑战，耐药结核病是全球结核

11、病控制工作的严峻挑战， 世界卫生组织估计，全球每年新产生耐多药结核世界卫生组织估计，全球每年新产生耐多药结核 病患者病患者5050万人、广泛耐药患者约万人、广泛耐药患者约5 5万人。能及时得万人。能及时得 到诊断者不足四分之一。到诊断者不足四分之一。 我国结核患者数和耐多药患者数均居世界第二位，我国结核患者数和耐多药患者数均居世界第二位， 耐药结核病的流行耐药结核病的流行 2007-20082007-2008年我国进行的耐药基线调查结果：涂阳年我国进行的耐药基线调查结果：涂阳 肺结核患者结核分枝杆菌总耐药率为肺结核患者结核分枝杆菌总耐药率为37.79%37.79%，其，其 中初治总耐药率为中初

12、治总耐药率为35.16%35.16%，复治总耐药率为，复治总耐药率为 55.17%55.17%，总耐多药（，总耐多药（mdr-tbmdr-tb）率为）率为8.32%8.32%，其中，其中 初治总耐多药率为初治总耐多药率为5.71%5.71%，复治总耐多药率为，复治总耐多药率为 25.64%25.64%，总广泛耐药（，总广泛耐药（xdr-tbxdr-tb）率为）率为0.68%0.68%，其，其 中初治患者为中初治患者为0.47%0.47%，复治患者为，复治患者为2.06%2.06%，根据此，根据此 次调查结果估算，我国每年新发耐多药肺结核患次调查结果估算，我国每年新发耐多药肺结核患 者者1212

13、万例，广泛耐药患者近万例，广泛耐药患者近1 1万例。万例。 耐药结核病的流行耐药结核病的流行 19991999年我省结核分枝杆菌耐药监测结果，年我省结核分枝杆菌耐药监测结果，3030个监个监 测点，总入选病例测点，总入选病例11361136例，培阳例，培阳10971097例，培阳率例，培阳率 96.6%96.6%，涂阳培阴，涂阳培阴3434例，例，3.0%3.0%，污染，污染5 5例，污染率例，污染率 0.4%0.4%，未发现非结核分枝杆菌，未发现非结核分枝杆菌，10971097例中初始例中初始859859 例，获得例，获得238238例，总耐药率例，总耐药率23.3%23.3%，初始耐药率，

14、初始耐药率 17.5%17.5%，获得性耐药率，获得性耐药率44.5%44.5%，总耐多药率，总耐多药率6.4%6.4%， 初始耐多药率初始耐多药率2.1%2.1%，获得性耐多药率，获得性耐多药率21.8%21.8%。 耐药结核病诊断耐药结核病诊断 药敏试验药敏试验 目的：诊断目的：诊断 耐药治疗耐药治疗 监测监测 诊断耐药结核病，满足对临床结核病患者耐药情诊断耐药结核病，满足对临床结核病患者耐药情 况的判定。况的判定。 选择和调整耐药结核病治疗方案、制定有效的标选择和调整耐药结核病治疗方案、制定有效的标 准化或个体化治疗方案。准化或个体化治疗方案。 开展耐药监测了解某一地区结核分枝杆菌的耐药

15、开展耐药监测了解某一地区结核分枝杆菌的耐药 水平和流行趋势。水平和流行趋势。 药敏试验方法药敏试验方法 基于检测标本基于检测标本 直接方法直接方法 直接用涂阳直接用涂阳( (涂片涂片1+1+以上以上) )标本进行试验标本进行试验 优点：快速得到结果，较好地反应病变部位菌群优点：快速得到结果，较好地反应病变部位菌群 的耐药性；的耐药性； 缺点：污染难控制，容易失败，很难确定接种量缺点：污染难控制，容易失败，很难确定接种量 / /菌活性。菌活性。 间接方法间接方法 使用培养物进行药敏试验使用培养物进行药敏试验 优点：更好地控制接种量优点：更好地控制接种量/ /菌活性菌活性 缺点：耗时长，及时性差缺

16、点：耗时长，及时性差 试验方法试验方法 世界卫生组织推荐的药敏试验方法世界卫生组织推荐的药敏试验方法 基于生长观察：基于生长观察： 固体培养方法固体培养方法 比例法比例法 绝对浓度法绝对浓度法 抗性比率法抗性比率法 基于生长检测（产生二氧化碳、基于生长检测（产生二氧化碳、 消耗氧气等）消耗氧气等） 液体培养法液体培养法 基于基因突变检测基于基因突变检测 探针杂交的方法探针杂交的方法 基因扩增及序列测定基因扩增及序列测定 传统试验方法传统试验方法 比例法比例法 法国的法国的 canetti , 1963canetti , 1963 临界菌群比耐药菌群数临界菌群比耐药菌群数/ /全菌群数全菌群数

17、1% 1% 、10% 10% 绝对浓度法绝对浓度法 德国的德国的 meisnnermeisnner， 1963 1963 临界药物菌落数（临界药物菌落数（1010、2020菌落）菌落） 抗性比率法抗性比率法 英国英国 mitchsonmitchson， 1963 1963 rr= mic rr= mic被检菌 被检菌/ /mich mich37rv 37rv 比例法和绝对浓度法的一致性比例法和绝对浓度法的一致性 比例法和绝对浓度法目前是我国常用的药敏实验 方法，综合以往国内相关报道，两种方法测试一 线4种药的一致性非常好，均达到了96%以上，耐 药率无显著性差异。目前全球基金项目和国家对 省级

18、和省级对市级质控都采用了比例法，也与跨 国实验室质控方法一致，与国际上逐步实现了接 轨。 开展传统药敏实验的要求开展传统药敏实验的要求 不同实验室操作（韩国）实验室工作人员结核感染不同实验室操作（韩国）实验室工作人员结核感染 风险的比率风险的比率 工作类型工作类型风险比率风险比率95% ci 涂片人员对非实验室人员涂片人员对非实验室人员1.4050.198-9.953 培养人员对非实验室人员培养人员对非实验室人员1.8890.267-13.373 培养人员对涂片镜检人员培养人员对涂片镜检人员1.3440.190-9.511 药敏试验对非实验室人员药敏试验对非实验室人员21.4784.502-1

19、02.479 药敏试验对涂片镜检药敏试验对涂片镜检15.2833.205-72.881 药敏试验对培养药敏试验对培养11.3702.386-54.187 比例法药敏试验方法比例法药敏试验方法 比例法药敏试验流程比例法药敏试验流程 对照培养基对照培养基 含药培养基含药培养基 药物储存药物储存液液 混合、摇匀混合、摇匀 基础液基础液 改良改良l-j 100ml 1ml 磨菌磨菌 分装分装 凝固凝固 分分装装 凝固凝固 1mg/ml菌悬液菌悬液 1010-4 -4 mg/ml 1010-2 -2 mg/ml 100倍稀释倍稀释 100倍稀释倍稀释 接种接种0.01ml 接种接种0.01ml 2-3周

20、周 新鲜菌新鲜菌落落 结果报告结果报告 计算耐药百分比：计算耐药百分比： 含药培养基上生长的菌落数含药培养基上生长的菌落数 耐药百分比耐药百分比= - = - 100% 100% 对照培养基上生长的菌落数对照培养基上生长的菌落数 若耐药百分比大于或等于若耐药百分比大于或等于1%1%，则认为受试菌对，则认为受试菌对 该抗结核药耐药。该抗结核药耐药。 结果计算结果计算 对照管应能计算出实际菌落数对照管应能计算出实际菌落数 4 4周后观察结果，如果生长不良，可稍周后观察结果，如果生长不良，可稍 延后报告结果，但不能超过延后报告结果，但不能超过6 6周周. .耐药菌耐药菌 长的慢，药效丧失）长的慢，药

21、效丧失） 无无药药 isoniazid ethambutol 接接种种物物 培培养养基基 0.2 mcg/ml 2.0 mcg/ml 10-3 + + 3 10-5 26 9 0 耐耐药药百分比百分比 34.6 0.1 结结果解果解释释 耐耐药药 敏感敏感 影响药敏试验准确性的因素影响药敏试验准确性的因素 实验室布局、设备、物资是否满足要求实验室布局、设备、物资是否满足要求 负责培养和药敏试验人员的能力负责培养和药敏试验人员的能力 工作量的保证工作量的保证 药物保存不当、浓度计算错误、效价计算不准确，药物保存不当、浓度计算错误、效价计算不准确， 稀释不准确影响药物的实际浓度稀释不准确影响药物的

22、实际浓度 药敏试验方法选择不当药敏试验方法选择不当 培养物：菌的新鲜程度、传代次数、代表性培养物：菌的新鲜程度、传代次数、代表性 影响药敏试验准确性的因素影响药敏试验准确性的因素 培养基：药物加入到不同培养基后活性的改变（含药培培养基：药物加入到不同培养基后活性的改变（含药培 养基的制备），培养基中某些拮抗剂或化学物质可干扰养基的制备），培养基中某些拮抗剂或化学物质可干扰 药物的作用，培养基中药物浓度变化（加热失活、过滤药物的作用，培养基中药物浓度变化（加热失活、过滤 除菌、不适宜的溶剂导致的不完全溶解）除菌、不适宜的溶剂导致的不完全溶解） 接种：接种： 接种量、菌液的分散度（接种量、菌液的分

23、散度（r r、s s）、代表性，稀释）、代表性，稀释 度，菌的活性；度，菌的活性； 稳定的孵育条件孵育温度和时间稳定的孵育条件孵育温度和时间 耐药的标准耐药的标准 药敏试验结果的判读药敏试验结果的判读 质量控制质量控制 若高稀释度菌液（若高稀释度菌液（1010-4 -4mg/ml mg/ml）在对照培养）在对照培养 基上生长的菌落数少于基上生长的菌落数少于2020个菌落，则应从个菌落，则应从 对照管传代培养，重复试验。对照管传代培养，重复试验。 每批试验以结核分枝杆菌参考菌株（每批试验以结核分枝杆菌参考菌株（h37rvh37rv 敏感株）敏感株） 做为敏感对照，以检测含药培养做为敏感对照，以检

24、测含药培养 基的质量、稀释和接种量等因素基的质量、稀释和接种量等因素。 室内质控室内质控 对照培养基的质控对照培养基的质控 可接种快速生长分枝杆菌，如偶然分枝杆可接种快速生长分枝杆菌，如偶然分枝杆 菌，如接种后菌，如接种后5 5天还未长出菌落，则培养基天还未长出菌落，则培养基 未达到质量要求。未达到质量要求。 药敏培养基的质控药敏培养基的质控 菌株菌株h37rvh37rv（actt27294actt27294） 实间质控实间质控 药敏试验的熟练度测试药敏试验的熟练度测试 对进行药敏试验的菌株进行系统的对进行药敏试验的菌株进行系统的 （耐药株）或随机（敏感株）抽查，（耐药株）或随机（敏感株）抽查

25、， 并采用双盲进行测试比较。并采用双盲进行测试比较。 抗结核药物敏感性试验熟练度测试抗结核药物敏感性试验熟练度测试 从从20082008年开始，省结核病参比室每年对宜昌、武年开始，省结核病参比室每年对宜昌、武 汉、荆州、咸宁、黄冈五个地市结防院所结核病汉、荆州、咸宁、黄冈五个地市结防院所结核病 实验室进行一、二线抗结核药敏试验熟练度测试。实验室进行一、二线抗结核药敏试验熟练度测试。 20132013年对全省年对全省1616个地市结防专业机构实验室、耐个地市结防专业机构实验室、耐 药定点医院实验室、专科医院实验室进行培训和药定点医院实验室、专科医院实验室进行培训和 测试，除一个实验室一线药，两个

26、实验室二线药测试，除一个实验室一线药，两个实验室二线药 结果不合格外，其他实验室结果非常理想。结果不合格外，其他实验室结果非常理想。 药敏试验的局限性药敏试验的局限性 药敏试验准确性高低与测试的药物有关；药敏试验准确性高低与测试的药物有关； 对于一线药物，对于一线药物，inhinh、rfprfp准确性高，而准确性高，而smsm、embemb和和pzapza的可的可 靠性和重复性较差。靠性和重复性较差。 对于二线药物如氨基糖苷类、多肽类和氟喹诺酮类的药敏试验对于二线药物如氨基糖苷类、多肽类和氟喹诺酮类的药敏试验 重复性和可靠性较好，其他二线药尚无可靠的药敏试验方法重复性和可靠性较好，其他二线药尚

27、无可靠的药敏试验方法 可靠性差的原因可靠性差的原因 与临床反应的相关性：临界耐药浓度、体外试验不一定完与临床反应的相关性：临界耐药浓度、体外试验不一定完 全反应药物在体内的作用全反应药物在体内的作用 方法本身的复杂性和不稳定性方法本身的复杂性和不稳定性 药敏试验的局限性药敏试验的局限性 药物浓度的不稳定，蛋白结合、热灭活、不完全溶解、过药物浓度的不稳定，蛋白结合、热灭活、不完全溶解、过 滤除菌和药物效价变化等均可导致药物损失滤除菌和药物效价变化等均可导致药物损失。 实验操作、培养基的实验操作、培养基的phph值、孵育的温度和时间都可影响药值、孵育的温度和时间都可影响药 敏试验结果。敏试验结果。

28、 二线药敏试验的临界浓度与药物的最小抑菌浓度接近，加二线药敏试验的临界浓度与药物的最小抑菌浓度接近，加 大了敏感和耐药的错分几率，导致可重复性较差。大了敏感和耐药的错分几率，导致可重复性较差。 二线药物有交叉耐药，分子机制不详。二线药物有交叉耐药，分子机制不详。 二线药敏试验结果的解释：二线药敏试验结果的解释： 报告耐药：很有可能治疗无效报告耐药：很有可能治疗无效 报告敏感：需要谨慎解释（结合用药史和临床反应）报告敏感：需要谨慎解释（结合用药史和临床反应） 说说 明明 医生应该详细了解病人的病史、准确记录用药史，用药时医生应该详细了解病人的病史、准确记录用药史，用药时 间越长，耐药的可能性就越

29、高。特别是常规治疗期间出现间越长，耐药的可能性就越高。特别是常规治疗期间出现 临床或细菌学治疗失败（涂阳或培阳）则高度提示耐药的临床或细菌学治疗失败（涂阳或培阳）则高度提示耐药的 产生。如果病人治疗超过产生。如果病人治疗超过1 1月仍涂阳或培阳，即使药敏结月仍涂阳或培阳，即使药敏结 果报告为敏感，也要考虑该药物果报告为敏感，也要考虑该药物“可能耐药可能耐药”。如果某一。如果某一 药物的既往用药史提示可能由于耐药而无效，即使实验室药物的既往用药史提示可能由于耐药而无效，即使实验室 报告该药敏感，也不能将其作为方案中的四个核心药物。报告该药敏感，也不能将其作为方案中的四个核心药物。 实验室报告耐药

30、，而病人从未使用过该药物的可能性也存实验室报告耐药，而病人从未使用过该药物的可能性也存 在，有可能感染的是原发性耐药株，也可能是实验室的错在，有可能感染的是原发性耐药株，也可能是实验室的错 误或某些二线药物药敏试验特异性有限所致。误或某些二线药物药敏试验特异性有限所致。 国家参比室推荐的耐药新诊断技术国家参比室推荐的耐药新诊断技术 方法商品检测目的 液体培养（2007年）bact/tlert 3d; mgit诊断结核感染及药物 敏感性 分子线性探针实验（2008年） genotype mtbdr and mtbdrplus；inno-lipa rif. tb； 诊断结核感染及对异 烟肼和利福平

31、的药物 敏感性 dna微阵列芯片法 生物结核分枝杆菌耐药基 因检测试剂盒 诊断结核感染及对异 烟肼和利福平的药物 敏感性 自动化检测和mdr筛选实验 （2010年） cepheid genexpert 仪器 和xpert mtb模块 诊断结核感染及对利 福平的耐药性 其他正在开发或评估的新技术其他正在开发或评估的新技术 方法方法商品商品检测目的检测目的 流体芯片法 mdr-tb检测 荧光定量pcr溶解曲线法检测mdr-tb/xdr-tb mods（显微镜观察药敏实 验） 无商品化试剂盒 检测分枝杆菌的药物敏感 性 噬菌体生物扩增法 诊断结核感染及药物敏感 性 新的固体药敏方法 硝酸盐还原试验（

32、无商品化试剂盒） 诊断菌株对异烟肼和利福 平的敏感性 薄层琼脂培养法（无商品化试剂盒） 诊断结核感染以及对异烟 肼和利福平的敏感性 颜色指示方法刃天青法（无商品化试剂盒） 检测菌株对利福平和异烟 肼的敏感性 耐药分子诊断的基本原理耐药分子诊断的基本原理 利福平/异烟肼耐药性的产生与结核分枝杆 菌特定基因某些位点的突变相关。 抗结核药抗结核药基因基因基因功能基因功能 利福平rpob编码dna依赖rna聚合酶，参与mrna转录 过程 异烟肼 katg 编码过氧化氢-过氧化物酶，参与inh体内 的转化 inha编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)依赖的 enoyl-acp还原酶，参与脂酸的合成 可使

33、用涂阳痰标本和培养物进行操作可使用涂阳痰标本和培养物进行操作 快速（快速（1天）天） 需需pcr实验室设施和技术实验室设施和技术 不能检测造成耐药突变的热点区域外的突变不能检测造成耐药突变的热点区域外的突变 价格比较昂贵价格比较昂贵 42 43 去去 污污 染染dna 提取提取扩扩 增增 杂杂交交清清洗，洗，检测颜检测颜色色结结果解果解释释 lpa操作流程操作流程 关于关于lpa的建议的建议 适用于地区及以上级实验室适用于地区及以上级实验室 仅适用于涂阳标本和结核分枝杆菌阳性培养物的检测仅适用于涂阳标本和结核分枝杆菌阳性培养物的检测 操作需要至少有操作需要至少有3个独立的实验室以避免交叉污染个

34、独立的实验室以避免交叉污染 仅能检测仅能检测mdr，xdr的检测仍需要依靠传统药敏试验的检测仍需要依靠传统药敏试验 可以独立作为可以独立作为mdr的诊断工具的诊断工具 对于对于mdr病人，仍需要传统的培养（固体或液体培养）病人，仍需要传统的培养（固体或液体培养） 检测治疗效果（培养阴转）检测治疗效果（培养阴转） 建议的覆盖面建议的覆盖面: 每每50100万人口至少需要万人口至少需要1个个lpa实验室实验室 结核耐药检测基因芯片结核耐药检测基因芯片 激光共焦扫描仪 软件判读 结核耐药检测芯片获北京市自主创新产品证书样品制备仪杂交仪 n 通 量：两个一线抗结核药 n 速 度： 6 小时（比传统药敏

35、试验法快 50-100 倍） n 灵敏度：103 cfu/反应 n 特异性：对照设计严谨；自动判读 基于rpob/katg/inha的基因突变，快速检测分离株或者痰 样本中结核杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）。 international journal of tuberculosis and lung disease, 13:914-920, 2009（if=2.3） 45 获国家医疗器械证书和欧盟ce认证 基因芯片基因芯片 基因芯片是指采用光导原 位合成或微量点样等方法 ，将核酸片段有序地固化 于支持物的表面，然后与 已标记的待测生物样品中 靶分子杂交，通过特定的 仪器对杂交信号的强度进 行

36、快速、并行、高效地检 测分析，从而判断样品中 靶分子的数量。 检测过程检测过程 杂交反应 杂交清洗 清洗干燥 扫描检测 数据分析 检测分析 pcr扩增 dna 提取 样品制备 芯片结果图例芯片结果图例 国家推荐意见国家推荐意见 在地市级以上结核病诊断实验室使用在地市级以上结核病诊断实验室使用 用于涂阳患者或者阳性培养物用于涂阳患者或者阳性培养物 xpert mtb/rif 检测结核分枝杆菌检测结核分枝杆菌 检测利福平耐药检测利福平耐药 直接标本检测直接标本检测 100分钟可获得结果分钟可获得结果 dna/rna 提取和纯化提取和纯化 扩增扩增 检测检测 传统核酸扩增传统核酸扩增 技术技术 dna/rna 提取和纯化提取和纯化 & 扩增扩