第六章 微生物生态学的研究方法

1、1 第六章第六章 微生物生态学的研究方法微生物生态学的研究方法 2 1.直接测定法直接测定法 利用光学和电子显微镜对样品中的微生物进行直接利用光学和电子显微镜对样品中的微生物进行直接 观察，并计算微生物数目或测定丝状微生物的长度，观察，并计算微生物数目或测定丝状微生物的长度， 其结果可以用每单位面积或每单位体积或重量的微生其结果可以用每单位面积或每单位体积或重量的微生 物数目来表示，以此来估计生物量。物数目来表示，以此来估计生物量。 其优点是能够使人们直接观察到天然样品的微生物其优点是能够使人们直接观察到天然样品的微生物 形态和微生物在自然样品所处的位置。形态和微生物在自然样品所处的位置。 缺

2、点是只能取少量的样品，与微生物所生活的整个缺点是只能取少量的样品，与微生物所生活的整个 自然环境相比，少量的样品不能代表整个自然环境。自然环境相比，少量的样品不能代表整个自然环境。 第一节第一节 微生物生态学研究的传统方法微生物生态学研究的传统方法 3 2.2.培养法培养法 培养微生物的方法是很多的，一般来说对所采集的样品应培养微生物的方法是很多的，一般来说对所采集的样品应 进行适当的稀释，以便每一个平板上只能生长有一定数目的进行适当的稀释，以便每一个平板上只能生长有一定数目的 微生物菌落。微生物菌落。 其最大优点便是可以计算自然样品中的活微生物数目，并其最大优点便是可以计算自然样品中的活微生

3、物数目，并 可以辨认真菌、放线菌和细菌。可以辨认真菌、放线菌和细菌。 其缺点是造成计算误差的因素很多。比如：其缺点是造成计算误差的因素很多。比如： a.a.自然中的许多微生物细胞成群粘接在一起，用普通的方法自然中的许多微生物细胞成群粘接在一起，用普通的方法 很难把它们分开，这样形成的菌落可能是由许多个细胞增殖很难把它们分开，这样形成的菌落可能是由许多个细胞增殖 而来的，而不是由单个细胞形成的菌落而来的，而不是由单个细胞形成的菌落. . 4 b.b.有些微生物在平板上只能形成微菌落，不便于肉有些微生物在平板上只能形成微菌落，不便于肉 眼观察。眼观察。 c.c.一般情况下实验室所用的培养条件很难满

4、足所有一般情况下实验室所用的培养条件很难满足所有 微生物的生长，所用的有限种类的培养基也无法微生物的生长，所用的有限种类的培养基也无法 满足所有微生物的生长。满足所有微生物的生长。 d.d.在平板上形成的丝状微生物菌落不知是从孢子而在平板上形成的丝状微生物菌落不知是从孢子而 来的还是从菌丝而来的。来的还是从菌丝而来的。 尽管如此，这种方法还是被广泛用于微生物生态尽管如此，这种方法还是被广泛用于微生物生态 学研究中，特别适合用于研究细菌生态学学研究中，特别适合用于研究细菌生态学. . 5 3.生理生化法生理生化法 同位素示踪法。我们知道一个微生物群体的大同位素示踪法。我们知道一个微生物群体的大

5、小，那么通过测定小，那么通过测定h h3 3标记的胸腺嘧啶组入微生标记的胸腺嘧啶组入微生 物群体物群体dnadna中的速率便可以估计微生物的代时。中的速率便可以估计微生物的代时。 代谢活力测定法。是分析某些特殊酶类的酶活代谢活力测定法。是分析某些特殊酶类的酶活 力，这一方法是假设所有待测的细胞都含有这力，这一方法是假设所有待测的细胞都含有这 些特殊的酶类，并且所有细胞以同样的能力使些特殊的酶类，并且所有细胞以同样的能力使 用这些酶类。用这些酶类。 6 测定自然样品中的测定自然样品中的atpatp含量也可以反映微生含量也可以反映微生 物代谢活力的大小和生物量的大小。物代谢活力的大小和生物量的大小

6、。 测定叶绿素的含量和其他光合色素的含量可测定叶绿素的含量和其他光合色素的含量可 以用来估计藻类和其他光合生物的生物量和以用来估计藻类和其他光合生物的生物量和 代谢活力。代谢活力。 最广泛使用的测定代谢活力的方法是估计整最广泛使用的测定代谢活力的方法是估计整 个微生物群体的呼吸作用和藻类的光合作用，个微生物群体的呼吸作用和藻类的光合作用， 测定的对象是测定的对象是o o2 2和和coco2 2量的变化。量的变化。 7 生理学的方法生理学的方法biologbiolog 微孔板法微孔板法 biolog gn 板是一种多底物的96 孔elisa 反 应平板。除对照孔只装有四氮叠茂，其余95孔作 为反

7、应孔还装有不同的单一碳底物。在进行elisa 反应时，各孔中的微生物利用碳底物，呼吸作用 产生电子传递，引起四氮叠茂发生还原反应变为 紫色。微生物对不同碳底物的利用情况可用发生 反应的孔的分布及反应孔的颜色变化 时间关 系即群落水平生理图谱（clpp）来表示。通过对 孔中颜色变化的光吸收值的测量，可获得较系统 的信息。 8 biolog 微孔板最初是由biolog 公司为了 鉴定纯种微生物而设计的，其碳源代谢指 纹图可用来鉴定1900多种细菌、酵母和霉 菌。1991 年，garland 首次将biolog 微 孔板应用于土壤微生物群落的研究。现在 biolog 微孔板已被广泛应用于描述各种环

8、境包括土壤、淡水、沉积物、活性污泥和 海水的微生物群落生理状况。 9 4.数学模型法数学模型法 研究微生物生态学过程中惯用的方法，是以感官研究微生物生态学过程中惯用的方法，是以感官 观察为基础，经过一些实验将搜集的资料加以分析和观察为基础，经过一些实验将搜集的资料加以分析和 解释，并进一步归纳、假设和推理。在这过程中，其解释，并进一步归纳、假设和推理。在这过程中，其 结果大多数是描述性的，数据基本是孤立的。将数学结果大多数是描述性的，数据基本是孤立的。将数学 研究应用于微生物生态学研究中，以统计数据和建立研究应用于微生物生态学研究中，以统计数据和建立 生态模型来定量描述微生物生态学问题。生态模

9、型来定量描述微生物生态学问题。 首先在实验室中建立人工的经过简化的环境。首先在实验室中建立人工的经过简化的环境。 分解成许多小的、较为简单的亚系统。这些亚系统分解成许多小的、较为简单的亚系统。这些亚系统 之间的相互作用，亚系统之内各种因素的作用则用数之间的相互作用，亚系统之内各种因素的作用则用数 学方程式描述。可以大大地压缩真实过程的时间、人学方程式描述。可以大大地压缩真实过程的时间、人 力和物力，并在短时间内调查生态演变过程的规律，力和物力，并在短时间内调查生态演变过程的规律， 并预测生态演变过程的发展趋势，提供最优利用方案。并预测生态演变过程的发展趋势，提供最优利用方案。 10 第二节第二

10、节 微生物生态学的分子生物学微生物生态学的分子生物学 研究方法研究方法 微生物分子生态学方法弥补了传统的微生物生态 学方法的不足，使人们可以避开传统的分离培养 过程而直接探讨自然界中微生物的种群结构及其 与环境的关系。 微生物生态学研究中采用的分子生物学方法主要 有核酸探针技术、pcr扩增技术、rrna序列同源性 分析方法、梯度凝胶电泳方法等。 11 一、核酸探针杂交技术一、核酸探针杂交技术 核酸杂交技术快速，能灵敏地探测出环境微生物中 特殊的核酸序列，并且用光密度测定法可直接比较 核酸杂交所得到的阳性条带或斑点就能得出定量的 结果，从而反映出相关微生物的存在及功能。 其基本原理是:人工合成能

11、与某类群微生物特征基 因序列互补的寡聚dna或rna探针，并以荧光或放射 性标记该探针，然后利用该探针与微生物基因杂交， 通过荧光显微镜技术或放射自显影技术对微生物的 群落结构进行分析和研究。 12 核酸探针杂交法的基本的步骤：先对 rrna(基因)序列比对，并对这些序列的特 异性进行鉴定，然后进行互补核酸探针的 合成和标记，最后对探针的特异性和测定 敏感性进行评价和优化。 目前已经进行测序的核酸序列数目很有限， 这样对某些生态系统中存在的微生物和核 酸序列就不可能进行全面的了解，必须对 各种生物的16srrna和23srrna进行测序和 研究，才能设计足够的探针来监测高度可 变的目标样品中的

12、所有微生物。 13 14 寡聚核苷酸探针由人工合成，一般为30kb左右， 具有很高的灵敏度，可用于检测环境微生物的单 一基因和点突变。 目前应用较多的寡聚核苷酸探针是根据细菌rrna 基因的多拷贝且高度保守的dna片段设计的。这种 技术在微生物生态学研究时具有重要的用途： （1）用于检测环境中的微生物、指示生物及某些特 定基因型的存在与否；（2）用于检测某一特定环 境中的微生物种群、数量、分布及其变化，从而 预测该环境中的微生物种群变化趋势；（3）用于 检测某些微生物的特定基因型在环境中的动态。 15 随着基因工程技术的发展，新的核酸分子 杂交技术不断出现和完善，核酸分子杂交 可按作用环境大致

13、分为固相杂交和液相杂 交两种类型。 固相杂交包括:组织原位杂交 、菌落原位 杂交 、斑点杂交 、southern印迹杂交 、 northern印迹杂交 、 固相夹心杂交 、固 化探针杂交、反向杂交 。 16 二、二、pcr特异性扩增技术特异性扩增技术 pcrpcr技术主要特点是短时间内在实验室技术主要特点是短时间内在实验室 条件下人为地控制并特异扩增目的基因或条件下人为地控制并特异扩增目的基因或 dnadna片段，使研究的目的基因及其环境样品片段，使研究的目的基因及其环境样品 中的微量微生物基因得到无限的扩增，为中的微量微生物基因得到无限的扩增，为 这些基因和微量微生物种群的研究提供了这些基因

14、和微量微生物种群的研究提供了 保证。使用保证。使用pcrpcr技术可将靶序列放大几个数技术可将靶序列放大几个数 量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作 定性或定量研究分析微生物群体结构。定性或定量研究分析微生物群体结构。 17 1、反转录pcr (rt-pcr)技术是利用反转录 酶，使样品中mrna反转录为dna，然后利 用dna分析方法进行研究。虽然在活的微 生物细胞中mrna的含量较高，但当细胞死 亡和裂解以后，释放到环境中的mrna迅速 被降解。因此， rt-pcr技术常被用来分 析环境样品中活体微生物生存状况和活性。 18 2、竞争性pcr曾被用来测定

15、受多环芳香烃污 染的沉降物中的编码邻苯二酚-2，3-加双 氧酶的dmpb基因的浓度。对pcr扩增dmpb的 基因片段进行人工改造，使其带有一个 40bp大小的缺失，作为pcr扩增的竞争模板。 因此，竞争模板的 pcr产物就比目的模板 的pcr产物短。用竞争性pcr对二者进行共 扩增，通过与竞争模板的浓度进行比较， 来定量沉降物中dmpb基因的浓度。 19 3、限制性片段长度多态性技术(rflp)是根据 不同生物个体或种群之间dna片段酶切位点 有所差异的特点，利用限制性内切酶进行 消化，产生长短、种类、数目不同的限制 性片段，然后对这些特定dna片段的限制性 内切酶产物进行分析，根据特定的限制

16、性 酶谱图可对群落中的微生物加以区分。 20 限制性片段长度多态性技术需要依赖southern技术， 需要克隆基因探针，dna的用量较大且纯度要求很 高，因此应用受到了一定限制。将pcr应用于rflp 的pcr-rflp技术则克服了这一缺点。 4 4、pcr-rflppcr-rflp法法是将pcr引物中的一条加以荧光标记， 反应后用合适的限制酶切、电泳分析，再根据片断 的大小不同以及标记片断种类和数量的不同分析群 落的结构及组成多样性。此方法对微生物遗传多样 性尤其是微生物的种以下分类具有重要意义。 21 5 5、随机引物扩增多态性、随机引物扩增多态性(rapd)(rapd)也是应用比较广泛的

17、 一项技术。rapd是用那些对某一特定基因的非特 异性的引物来扩增某些片段。rapd分析用于探测 含有混合微生物种群的各种生物反应器中的微生 物多样性。用rapd分析所得到的基因组指纹图谱 在比较一段时间内微生物种群的变化以及比较小 试规模和中试规模的反应器方面是有用的，但还 不足以用来估测群落的生物多样性。 22 6 6、扩增片段长度多态性、扩增片段长度多态性(aflp)(aflp)是rflp技术和pcr 技术相结合发展而成的一种新型dna指纹图 谱技术。具有可靠、有效地揭示微生物多 态性水平的能力，为研究微生物属以下物 种之间的亲缘关系，乃至菌株间差异提供 了非常有效手段。该技术的主要步骤

18、：（1） 样品染色体dna的提取和纯化；（2）dna的 修饰和模板的制备；（3）aflp反应；（4） 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析pcr产物；（5） 放射自显影及数据的数值分析。 23 aflpaflp 技术与其他的dna 指纹技术相比有其独特的 优点：（1）aflp 标记具有比rflp 、rapd标记更 为可靠、有效的揭示物种多态性水平的能力，为研 究原核生物属以下物种之间的亲缘关系，乃至菌株 之间关系提供了一种有效手段；（2）具有一定的 灵活性，可通过特异性pcr 引物设计和内切酶组合 的选择，来调整aflp 图谱中限制性片段的适宜数 目；（3）由于使用了严格的pcr条件和高分辨率的 聚丙烯酰胺

19、凝胶电泳，因而重复性好，分辨率高。 24 7 7、末端限制性片段长度多态性、末端限制性片段长度多态性( t-rflp)( t-rflp)，是根据 16s rrna 的保守区设计通用引物。其中一个引物 的5端用荧光物质标记。提取待分析样品的总 dna，以它为摸板进行pcr扩增，所得到的pcr产物 一端就带有这种荧光标记。将pcr产物用合适的限 制性内切酶消化。由于在不同细菌的扩增片段内 存在核苷酸序列的差异，酶切位点就会存在差异， 酶切后就会产生许多不同长度的限制性片段。消 化产物用自动测序仪进行检测，只有末端带荧光 标记的片段能被检测到，而其他没有带荧光标记 的片段则检测不到。这些末端标记的片

20、段就可以 反映微生物群落组成情况，因为不同长度的末端 限制性片段必然代表不同的细菌，也就是说一种 末端限制性片段至少代表一种细菌。 25 t-rflpt-rflp主要应用于微生物群落组成和结构、微生 物系统发育及其菌种鉴定等研究，是一种应用比 较广泛的微生物生态学研究方法。该方法可降低 图谱的复杂性，使结果易于分析，且重复性好， 结合克隆、测序，不仅可对已知菌进行鉴定，还 有助于发现新的未知菌，是细菌培养前大量筛查 粪便标本菌群的有用方法。 26 8 8、单链构象多态性、单链构象多态性(sscp)(sscp)利用dna片段核苷酸组 成的差异，造成单链构像的不同，使单链 dna或rna分子在电泳

21、时产生特异性谱带。 被应用于微生物鉴定、微生物区系、微生 物多样性等研究领域。此法的原理是：dna 单链构象具有多态性，由于碱基序列不同 而影响其空间构象，它的正常序列与变异 序列的单链构象不同，因此在电泳上的迁 移率也不同。从而可以在非变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳中来分析dna单链中的基因突变。 27 其主要步骤是：（1）提取细菌基因组dna； （2）用pcr扩增16srdna或16s-23srdna间 隔区片段；（3）将特异的pcr扩增产物变 性，而后快速复性，使之成为具有一定空 间结构的单链dna分子；（4）该单链dna 分子进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳； （5）银染或放射自显影；（6）分析

22、得到 的特异指纹图谱，与标准菌株的图谱相比 较，即可分析菌群，对菌株进行鉴定。亦 可对特异条带回收、测序，进行菌种鉴定 和分类。 28 三、三、rrna基因同源性分析方法基因同源性分析方法 rrna基因同源性分析方法是综合应用多项 分子生物学技术对细菌中rrna基因进行分 析，从而揭示微生物多样性。这是分子微 生物生态学中最重要的方法，取得的成果 也最多。rrna在所有的微生物中，功能和 进化上是同源的，同源物种之间rrna结构 是相当保守的。因此，为了确定一个分离 物为一个分类单元，或证明属于一个新的 分类单元，rrna基因序列分析还是最可靠 的方法。 29 rrnarrna序列分析技术与其

23、它分子生物技术以及传统 的纯种培养相结合，具备分析微生物多样性及其 发现新物种的能力，而且提供了一种摆脱传统的 纯种培养方法鉴定环境微生物的途径，并已被广 泛应用于对诸如共生细菌和古细菌、趋磁细菌、 海洋微型浮游生物以及土壤细菌等微生物类群的 研究，并发现了众多未知的新序列。 rrnarrna方法还 应用到土壤细菌的检测、基因工程菌的安全性检 查、环境中微生物间的基因转移等诸多方面。但 是在实际应用中，存在基因文库构建、全部序列 测定周期长，工作量大，费用高等问题。 30 16srrna序列分析主要步骤：（1）提取基 因组dna；（2）利用16srrna基因两端的保 守序列作为pcr的引物，p

24、cr扩增且纯化； （3）以pcr的产物为模板直接进行16srrna 序列分析；（4）ta克隆建库或直接测序； （5）用blast对所得序列进行比对分析。 31 四、变性梯度胶电泳技术四、变性梯度胶电泳技术 变性梯度凝胶电泳(dgge)的原理是使用一 对特异性引物，pcr扩增微生物自然群体的 l6s rrna基因，产生长度相同但序列有异 的dna片段的混合物。然后用dgge分离产物 混合物 dgge方法可用于微生物群落结构的研究、 微生物种群动态的分析、富集培养物及分 离物的分析、核糖体rna同源性的分析。 32 该方法扩增环境样品的16srrna的部分基因 序列(100400bp)，通过dgg

25、e或tgge分离， 收集不同条带的dna测序，再同基因文库中 的现有序列比较，即可确定微生物的种类。 该方法的要点在于pcr引物的选择。由于扩 增的环境样品成分复杂，所以研究人员都 选择了核糖体小亚基的dna的保守序列作为 引物。由于电泳的限制，被分析的片断不 能大于400bp。为了便于电泳的分析，提高 分辨率，引物的5端有一个40bp左右的发 夹结构，提高了引物合成的成本。 33 34 dgge对对原水及活性污泥的分原水及活性污泥的分 析析 原水原水 as 出水出水原水原水 as 出水出水 35 原水测序结果原水测序结果 dgge band accession number %identitymost closely related bacterial sequence 1dq10563997%uncultured bacterium 2dq20530991%uncultured