以碱处理玉米棒芯为原料直接生产丁醇的厌氧梭菌混菌发酵过程及代谢工程研究

1、以碱处理玉米棒芯为原料直接生产丁醇的厌氧梭菌混菌发酵过程及代谢工程研究丁醇是一种大宗的化工原料和新一代的可再生替代能源。近年来 , 在化石资 源枯竭、环境污染加剧等多重压力下 , 传统的丁醇发酵 , 特别是以丰富廉价可再生 的木质纤维素为原料的丙酮丁醇发酵被重新重视起来。木质纤维素丁醇的生产过程涉及纤维素酶类的生产 , 木质纤维素的酶法降解 ,己糖、戊糖的转运和利用以及丁醇发酵等多个步骤 ,工艺复杂 ,使得木质纤维素产丁醇成本居高不下 , 缺乏市场竞争力。利用某些厌氧菌分泌的多酶复合体一一纤维小体,统合生物加工工艺（consolidatedbioprocessing,CBP能将产酶、水解和溶剂

2、发酵集成在一个反应器内进行 , 可以有效简化工艺 , 减少操作费和设备费 ,降低成本 , 提高效率。要利用CBP法高效生产丁醇，参与该过程的微生物，既要能够高产多种木质 纤维素水解酶类 , 又要能够高效利用水解得到的己糖、戊糖生产丁醇。这可以通 过两类方法实现：一是将厌氧的木质纤维素降解菌和能同时利用己糖和戊糖的丁 醇生产菌混菌培养；二是对纤维素降解菌进行遗传改造 , 赋予其丁醇生产能力 ,或者对丁醇生产菌进行遗传改造 , 赋予其木质纤维素降解能力。本论文在这两方面都进行了探索。 本文首先考察了 3 种研究得较多的纤维小的发酵特性。体生产厌氧梭菌解纤维梭菌、 热纤梭菌和嗜纤维梭菌对碱处理后的玉

3、米棒芯(alkali extracted corn cobs, AECC)分析和比较了三种菌在 AECC降解、可发酵糖累积、发酵产物的生产等方面的优劣势后，发现热纤梭菌在AECC降解和可发酵糖的累积上有明显优势，而嗜纤 维梭菌在AECCt解和有机酸（特别是丁酸）生产上有明显优势，均可能适宜与丁 醇生产菌混菌发酵。解纤维梭菌由于生长和代谢缓慢 , 暂不考虑作为纤维素降解 菌用于混菌培养。为克服前人研究时遇到的混菌发酵过程中溶剂发酵总停留在产酸阶段的问 题,我们提出了一种新的热纤梭菌和拜氏梭菌偶联发酵策略 ,即先累积充足的可发酵糖后再开始ABE发酵。根据可发酵糖的累积和 ABE发酵对CBP过程的影

4、响,分别考察了热纤梭菌和拜氏梭菌的培养条件。并在此基础上进一步优化了双菌混合培养的方法。在组合优化条件下 , 热纤 梭菌和拜氏梭菌偶联发酵体系在不到 200 h内降解了 88.9g/L的AECC生产了 19.9g/L的总溶剂,包括3.96g/L的丙酮,10.9 g/L的丁醇以及5.04 g/L的乙醇。相比于优化前，AECC降解提高了 81.0%,溶剂产量提高了 70.3%。在上述混菌培养体系中 , 由于热纤梭菌与拜氏梭菌的培养温度不匹配 , 导致偶联发酵过程分 两阶段进行 , 对溶剂的生产强度造成了一定的影响。虽然嗜纤维梭菌的生长速率略慢于热纤梭菌 , 但其最适生长温度与拜氏梭菌 接近, 有利

5、于实现同步糖化发酵。 此外, 嗜纤维梭菌在降解纤维素的同时还能生产定量的丁酸 , 可为拜氏梭菌提供更多的丁醇生产前体。因此, 论文还构建了嗜纤维梭菌与拜氏梭菌恒温混菌培养体系。通过对混菌培养过程中拜氏梭菌接种时机、两菌接种比例、pH控制策略等条件的考察和优化，该混菌体系在88 h内降解了 68.6g/LAECC，生产了 11.8g/L的溶剂，其中乙醇 0.87g/L, 丁醇 8.30g/L, 丙酮 2.64g/L 。与热纤梭菌与拜氏梭菌的偶联发酵体系相比 , 嗜纤维梭菌与拜氏梭菌恒温混 菌发酵体系的溶剂产量虽然略低一些，但发酵时间缩短了近120 h, 丁醇生产强度 提高了 90.6%。此外，还

6、利用实时荧光定量PCF监测了两菌在混菌发酵过程中数量和比例的变化情况 , 初步分析了两菌种群之间的竞争与合作关系 ,但是这种关系的分子机制仍有待研究。由于混菌发酵过程需要兼顾不同微生物的生长和代谢特点 , 调控较单菌发酵 略为复杂。为实现嗜纤维梭菌单独利用AECC生产丁醇,尝试建立了嗜纤维梭菌的 遗传操作系统。借鉴丙酮丁醇的电转方法 , 在筛选出合适的抗性标记和复制子的基础上 , 首 次建立了嗜纤维梭菌的电转化方法 , 成功将质粒 pXYl 通过电转化导入嗜纤维梭 菌中。对影响质粒电转化的因素做了考察和优化，优化后质粒pXY1的电转化效率 达到76.8/卩g DNA,相比于优化前提高了 15.

7、7倍。考察了嗜纤维梭菌对丁醇的耐受性，发现嗜纤维梭菌在10 g/L的丁醇浓度下,仍能较好地生长。将来自丙酮丁醇梭菌的醇醛脱氢酶基因 adhE2(CA- P0035)在嗜纤维梭菌中过表达 ,首次实现了梭菌单独直接利用木质纤维原料生产正丁醇 ,但丁醇产量只有 0.374g/L, 推测可能与竞争性代谢途径过多及还原力供应不足有 关。利用新开发的嗜纤维梭菌的遗传操作系统 ,构建了嗜纤维梭菌丁酸激酶过表达突变株 743B(pXY1-Pptb-Clocel buk) 和拜氏梭菌的酸回用途径增强突变株8052(pXY1-Pptb-Cbei ctfA/B), 初步的间歇发酵实验表明 ,二者混菌培养在 108 h内，降解了 54.5 g/L AECC,生产了 9.32 g/L溶剂,其中丙酮1.73 g/L, 丁醇6.47g/L,乙醇1.12 g/L。与出发野生型菌株的混菌过程相比,AECC降解仅增加了 16.5%,但是丁醇产量提高了 57.4%,说明在嗜纤维梭菌和拜氏梭菌中分别增强丁酸生产途径及酸回用途径的过表达确实提高了 AECC勺丁醇和溶剂转化率。通过分批补料策略 ,在108 h 内,混菌体系分解了 75