慢病毒使用操作指南

1、慢病毒使用操作指南一、慢病毒的储存与稀释：1. 病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将 病毒暂时放置于4 C保存；如需长期保存请放置于80C （病毒置于冻存管，并使用 封口膜封口）注：A.病毒可以存放于-80C 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6 个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度。B.反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%因此在病毒使用过程中 应尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使 用量进行分装。2 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培 养目的细胞用PBS或无血清培养基（含血

2、清或含双抗不影响病毒感染）混匀分装后 4C保存（请尽量在三天内用完），分装后使用。二、慢病毒用于体外（in vitro ）实验：感染培养原代细胞和建系细胞1. 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invabio提供的慢病毒之前 可以通过查阅相尖文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI值）以及在体内（in vivo ）注射所需要的病毒量。如果没有相尖文献支 持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI值）（使用24孔板检测病毒 对目的细胞的亲嗜性）2. 慢病毒感染目的细胞预实验 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项A. 测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒

3、亲嗜性较高的（HEK293T，Hela）细胞作为平行实验的对照细胞。B. 在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上， 含有血清、双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。C. Invabio提供的病毒单位为TU/ml,即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒 数。 如：病毒滴度为1X108 TU/ml即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有 生物活性 的慢病毒颗粒。 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病 毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基

4、稀释病毒原液第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3-5X104个目的细 胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100卩I ;进行病毒感染时 细胞的融合度约为70%左右。第二天，观察细胞生长状态，如细胞状态较好则开始实验：1、取出4C保存的病毒，使用台式离心机离心20秒（使病毒完全悬于离心管底部即 可）；如果是冻存在809的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实 际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含 有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。2、病毒准备好之后，从培养箱中拿出细胞，a使用移液器吸取

5、准确体积的病毒液加入准备好的培养基b吸去原细胞培养器皿中的培养基（如果细胞生长良好，密度适宜，则不用换 液）c在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液d混匀后放于二氧化碳培养箱（37C、5%CO） 2孵育过夜注：感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，所以务必保证加病毒 之前，细胞处于良好的生长状态。如果慢病毒对目的细胞的感染效率偏低，则可以通过提高MOI值来增加其感染效 率，但是当MOI高于20时，我们建议客户在培养基中加入ploybrene（8卩g/ml左右）来提高病毒的感染效率。第三天，更换培养液：一般在24小时候后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养 液；在感染后观察细胞状

6、态，如果慢病毒对细胞有明显毒性作用而影响细胞生长状 态，可以最短在加病毒4小时候更换新鲜培养液后继续培养（建议在812小时更换 为宜）。第一次换液后，如果慢病毒对细胞没有明显毒性作用，按照正常培养条件培 养换液。第六天，感染效率检测：在倒置荧光显微镜观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞 的效率；如何由于目的基因较大而造成选择的载体不能携带Marker Ge ne的，可以 通Real-time RT-PCR佥测目的基因的表达来拍评估感染效率。三、慢病毒使用注意事项1病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通超净工作台操作病毒，请不要 打开排风机。2.病毒操作时请穿实验服，带口罩和手套。3. 操作病毒

7、时特别小心不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台有病毒污 染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头，离心 管，培养板，培养液请于84消毒液或1%SDS中浸泡过夜后弃去。4. 用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板。用 70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前，用70%乙 醇清理显微镜实验台。5. 如需要离心，应使用密封性好的离心管，或者用封口膜封口后离心，而且尽 量使用组织培养室内的离心机。6. 脫掉手套后，用肥皂和水清洗双手。四、悬浮细胞感染简单步骤1-根据细胞的量将细胞在15ml管中离心收集然后用100200ul的无血清 培养液 稀释细胞沉淀，以细胞完全浸没在培养基中