格式用HPLC法的从中药中筛选血管紧张素转化酶抑制剂

1、用HPLC法从中药中筛选血管紧张素转化 酶抑制剂 天然产物研究与开发 NatProdResDev2008,20:728-730,755 文章编号:10016880(2008)04-0728-04 用HPLC法从中药中筛选血管紧张素转化酶抑制剂 洪韫嘉，肖晓峰，陈波，姚守拙 湖南师范大学化学生物学及中药分析省部共建教育部重点实验室，长 沙 410081 摘要:本文发展了一种从中药中筛选血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂 的高效液相色谱法以马尿酰一组氨酰一 亮氨酸为反应底物，人体血浆中内生的 ACE作为反应用酶，反应所生 成的马尿酸为检测指标，未加酶抑制剂的 反应为空白对照用阳性药物卡托普利对本方法

2、进行了验证应用本方 法对中药提取物进行了 ACE抑制活性 的筛选，其中地龙的ACE抑制活性最强，其Ic卯值为2.57mg/mL用 HPLC法筛选中药ACEI且有很好的精密 度和准确性. 关键词:血管紧张素转化酶；抑制剂;高效液相色谱；中药提取物 中图分类号：R284.2;Q946.91文献标识码:A Scree nin gofA ngiote nsin conv erti ngEn zymel nhibitorsin Traditio nalChi neseMedici nebyHPLC HONG Yun-jia,XIAOXiao fen g,CHENBo，丫 AOShouzhuo KeyLa

3、boratoryofChemicalBiologyTraditi on alChi neseMedic in eRe search. Min istryofEducatio n, Hu nanN ormalu ne,Cha ngsha410081,Chi na Abstract:Amethodforscree ningan giote nsin conveningen zyme(ACE)i nhi bitorsfromtraditi on alChi nesemedici neby HPLChasbee nimproved.Taki ngN hippuryl His Leutetrahydra

4、tea nde n doge no usACEi nhuma nplasmaassubstrate an dcatalystrespectively,i nsituhippuricacidisqua ntitatedasa nalyticali ndexw iththereactio nwithoutaddi ngin hibi totsasabla nkcon tro1.These nsitivityofthemethodWastestedbydetermi natio n ofthecompetitivei nhibitorcaptopril. Extractio no ftraditi

5、on alChi nesemedic in efora ngiote nsin conveningen zym ein hibitorswasscree nedbythismethod.E tracti ono fthelowestlC50valueswas2.57mg/mLfromPheretima.Theprese nta pproachhasgoodprecisi onan daccu cy- Keywords:a ngiote nsin conveningen zyme;i nhibitor;HPLC;extractio noftr aditi on alChi nesemedic i

6、ne 血管紧张素转化酶(angiotensin2convertingen zyme,简称ACE)是肾素一血管紧张素系统的重要酶 类，其作用主要使血管紧张素I水解并转化为血管 紧张素H,后者是维持血压的重要因子，血管紧张素 转化酶活性升高导致血管紧张素H的生成增加以及 钝化缓激肽均是高血压的主要诱因卫.抑制ACE 活性并以此筛选ACE抑制剂是研究和评价降压药 物的重要方法目前，对ACE抑制活性的检测主要 有分光光度法和高效液相色谱法(HPLC)E24. 前者与后者相比操作复杂准确性低这些方法选用 的ACE 一般从兔肺中制得，而实验室自制兔肺ACE 工作量大滩以保障酶的活力，从国外进口费用高， 收

7、稿日期2007-04-20接受日期：2007-06-25 基金项目：” 973中药药性成因研究”课题(2006CB504701) $通讯作者 Tel:86-7314865515 增加了实验成本为解决这一问题，本文以人类空 白血浆作为ACE的来源，建立了 HPLC检测ACE抑 制活性的方法，并将此法用于传统中药的筛选我 国许多传统中药对治疗咼血压等心血管疾病已有很 好的疗效，但从中药中筛选ACEI的文献报道不多， 因此,本文希望为从中药中筛选出 ACEI做一些前 期的工作. 1材料与方法 1.1材料与仪器 卡托普利（99%）和马尿酸（99%）标准品 均购于中国生物药品鉴定所；马尿酰一组氨酰一亮氨

8、 酸（N hippuryl,His Leutetrahydrate简称 HHL）购于 Sigma公司;地龙潢芪瞿麦，山梔子茜草,丹参购 于长沙市麓谷大药房；色谱纯乙睛购于Tedia公司； 其他试剂均为国产分析纯；水为实验室自制双蒸水； 729 洪韫嘉等：用HPLC法从中药中筛选血管紧张素转化酶抑制剂 肝素抗凝的新鲜血浆由长沙中心血站提供，使用前 置于40 C冰箱中保存. 银河501型超级恒温器（中国重庆）;ZK 一 82B 型真空干燥箱（中国上海）;Eppendof5804RMulti purpose高速低温离心机（美国纽约）;岛津10AD高 效液相色谱仪（配有ShimadzuLCsoluti

9、on工作站）; 岛津10AVP紫外检测器. 1.2实验方法 l. 2.1色谱条件 采用 ODSC 分析色谱柱（250mmx4.6l13ln,5 m,大连江申分离科学技术公司）,检测波长设为 228nm柱温室温;流动相（0.1%甲酸,0.1%三乙 胺）水:（O.1%甲酸,0.1%三乙胺）乙腈=78:22. 1.2.2试剂的配置 HHL溶液:取HHL适量，以O.1mol/L硼酸缓 冲液(pH=8.3,含 0.3mol/LNaC1)配成 4.0retool/ LHHL溶液 卡托普利溶液：按所需浓度，取适量卡托普利样 品，用0.1mol/L硼酸缓冲液(pH=8.3,含0.3mol/ LNaCI)溶解，

10、再用同种缓冲液稀释到所需浓度. 马尿酸标准液：取马尿酸标准品适量用双蒸水 配制成不同浓度的马尿酸标准液. 中药提取物溶液：将以上中药粉碎，以1:10(W: v)的比例加入双蒸水，水浴回流2h,离心后过滤， 保留清液,继续向残渣中加入同样量的双蒸水，平行 提取三次，合并滤液，水浴蒸干.用O.1mol/L硼酸 缓冲液(pH=8.3,含0.3mol/LNaC1)溶解蒸干后 的各中药提取物，并用同种缓冲液稀释到所需浓度. 1.2.3ACEI活性的检测 HHL溶液与空白血浆反应的总体积为 100. 空白对照组的组成为:50LHHL溶液,2OL缓冲 溶液和5OL空白血浆；对应实验组的组成为：50 IxLH

11、HL溶液,2OL抑制剂溶液(卡托普利或中药 提取物溶液),5OL空白血浆.在37C恒温水浴 中反应40rain后加入120lxL乙腈终止反应，震荡 10S后离心10rai n(10000rpm) 取上清液进样10 L. 124测定原理 HHL和ACE恒温水浴时，能在ACE的催化下 水解生成马尿酸.实验组的ACE活性受到ACEI的 抑制作用要比对照组生成的马尿酸的量要少因 此，可以通过检测马尿酸的生成量来评价 ACEI对 ACE活性的抑制率计算公式为： R=（1 一 B/A）X100% 式中，为ACEI样品对ACE活性的抑制率,A 为对照组生成马尿酸的峰面积,B为实验组生成马 尿酸的峰面积. 2

12、结果与讨论 2.1HPLC法分析 在1.2.1的条件下,ACE活性抑制反应体系的 HPLC色谱图如图1所示，在8rain中之内反应底物 HHL和反应产物马尿酸得到了完全的基线分离. 这比文献4.上所报道的时间缩短，可相对快速地用 于ACEI筛选.图1a空白对照与图1b实验对照相 比，生成的马尿酸峰面积明显减小，说明加入抑制剂 后,ACE的活性受到了抑制. 125 100 E75 50 25 0 0.01.02.03.04o5.06.07.08.00,01.02.03.04.05.06.07.08,0 rai nrain 图1HPLC测定反应体系的色谱图 Fig.lThechromatogram

13、sofreactio ndetermi nedbyHPLC Mobilephase:aee on itrile distilledwater(22:78,v/v),bothe on tai nin g0.1%formicacida ndO.1%triethylami ne;flowrate:1mL/ min; detecti on:228nm. 2.2校准曲线以及检测限 在0.010.5mmol/L范围内，马尿酸的峰面积 Y与浓度x(o.010.5mmol/L)的线性回归方程为： Y =1.O118XIO+6132,r=O.9998,说明马尿酸的 浓度与检测出的峰面积成线性关系，因此可以用 表

14、1空白组反应液中马尿酸的回收率(n=9) Table1Recoveriesofhippuricacidi nbla nkreacti on(n=9) 730天然产物研究与开发 HPLC外标法来对马尿酸进行定量检测；将马尿酸 进行稀释,得出马尿酸的最低检测限为10pmol/L (S/N=3). 2.3方法的精密度与准确性 在未经反应的对照组溶液中，分别加入浓度为 0.01,0.1,0.5mmol/L的标准马尿酸溶液，再按 1.2.3的方法处理样品，通过检测并计算马尿酸的 平均回收率来考察该方法处理样品的准确性，结果 如表1所示.马尿酸的回收率在 95.8105.0之 间,相对标准偏差(RSD)为

15、1.82%(=9). 将对照组反应液中马尿酸的峰面积重复测定6 次，其RSD为1.82,说明本方法精密度良好. 2.4卡托普利对ACE抑制活性的检测 用1.2.3的方法对不同浓度的卡托普利标准液 进行检测，其结果如图2所示.随着卡托普利浓度 的不断提高，对ACE的抑制率也呈上升趋势，经计 算其lc.值为24.31 nmoVL.不同文献报道卡托普 利对ACE的活性抑制率是不同的J,其Ic.值范围 在7.5 X0.一 2.2 X0 一 mol/,L之间,本方法所得到 的卡托普利的Ic.值也在这个范围之内，说明本方 法具有可行性. 表2中药提取物溶液的Ic.值 Table2ThelC5ovalues

16、oftraditi on alChi neSemedic in eextracts 提取物 Exffact Ic50 值 IC5Ovalue 地龙 丹参 山梔子 瞿麦 黄芪 茜草 2.57 33.32 33.19 36.42 59.31 52.99 3结论 国内目前对ACE活性的检测,ACE的来源主要 有两种，或是由国外进口，或是从动物组织中自制 从国外进口一般费用较高，实验室自制需要很大的 工作量，并且还很难保证ACE的活性.人类的空白 血浆易得,费用低，用HPLC对反应体系进行分析， 操作简单,速度快，准确性高用本方法对强抑制剂 卡托普利进行了检测，得出抑制活性的lc.值与文 献值相近J,

17、说明本方法具有一定的可行性，可用 于ACEI的筛选. 本文对几种中药提取物进行了 ACE活性的初 步筛选，山梔子,瞿麦,黄芪和茜草对ACE的抑制活 性还是首次报道，其结果可以证实这几种中药都对 ACE活性都具有抑制作用，因此从中药中筛选 ACEI是很有意义的，一方面可以从抑制ACE活性 的角度探讨中药的降压机理，另一方面还可以为开 发新型的ACEI类降压药物奠定基础. 图2不同浓度卡托普利对ACE抑制曲线参考文献 Fig.2 In hibiti ono fACEbycaptoprilatdiffer ntconcen trati on 2.5中药提取物对ACE抑制活性的检测 几种中药提取物溶液

18、对 ACE的抑制活性的 lc.值如表2所示.高小平等报道丹参对ACE抑 制活性的主要有效成分是丹酚酸 B,而其他中药对 ACE的抑制作用还是初次报道.其中山梔子，瞿麦 与丹参提取物的lc.值比较接近，因此有必要对这 两种中药进行更深入的研究.大量文献报道了 地龙的降压功效，但其降压机理还不十分明确，耿秀 芳仅做了地龙低温水浸液对ACE活性的抑制率， 没有给出抑制活性的lc值本文检测出地龙提取 物的lc.值为2.57mg/mL,这一值比某些蛋白酶解 物的lc.值还要低，因此可以说明在地龙提取物 中含有很强的ACEI. ICushma nDW,Che un gHS.Spectrophotometr

19、icassaya nd propertiesofthea ngiote nsir convertingen zymeofrabbit lun g.BiochemPharmaeol,1971,20:1637-48. 2WuJP,ukORE,MuirADmprovedmethodfordirect highperforma nceliquidchromatographyassayofa ngiote nsi conv ert ingen zyme catalyzedreacti on s.JChromatogrA, 2002,950:125-30. 3wuQY（吴琼英）,MaHL（马海乐）,LuO

20、L（骆琳）,eta1. In hibitoractivitybyhighperforma nceliquidchromatogra pby.Ch in JChromatograph y色谱）,2005,1:79 81. 4XuRR（徐榕榕）,TaoGJ陶冠军）,LIJw（李进伟）,et a1.Determ in ati onofan giote nsir convertingen zymaticactivity byHPEC.Zhe ngzhoul nstituteTech 河南工业大学学 报）,2oO5,4:18-21. （下转第755页） V01.2O谭庆伟等:臭椿化学成分及生物活性研究进

21、展 755 27SoulelesChr,KokkalouE.A newcarbo n ealkaloidfrom Aila nthusahissima.Pla ntaMedica,1989,55:286-287. 28ZhaoCC（赵春超）,WangJH（王金辉）,Liw（李文）,et a1.Study on thechemicalc on stitue ntsoffruitsofAila nthus altissimaSwi ngle.Chi nJMedChe m中国药物化学杂 志）,2003,13:211-214. 29ZhaoCC,ShaoJH,LiX,eta1.A ntimicrobi

22、alco nstitue nts fromfruitsofAila nthusaltissimaSwi ngle.ArchPaRes. 2005,10:1147-1151. 30BoryG,Clair MaezulajtysD.Lipidc ontentan dfattyacid compositi ono fseedsofAila nthusaltissima（Mil1.）Swi ngle （Simaroubaceae）.I ndia nJPIa ntPhysiol,1989,32:116. 31Masteli6J,Jerkovi6I.Volatileco nstitue ntsfromth

23、eleaves ofyo ungan doldAila nthusaltissirna（Mil1.）Swi ngletree. CroaticaChemieaActa,2002,75:189197. 32TamuraS,FukamiyaN,MouXY,eta1.C onversiono fquass no idsfore nhan ceme ntofi nhibitoryeffectagai nstEpstei Barrvirusearlya ntige nactivatio n.ln troductio no flipophilic sidechai nan desterificatio n

24、o fdiosphe no1.Chem,Parm Bull,2000,48:876878. 33Oka no:M,FukamiyaN,TagaharaK,eta1.A ntHIVactivity ofquass in oids.Bioorga nicMedici nalChemLett,1996,6: 701-706. 34OhmotoT,KoikeK.A ntiherpesactivityofSimaroubaceaea kaloidsi nvitro.ShoyatmgakuZasshi,1988,42:160162. 35SeidaAA,Ki nghomAD,CordellGA,eta1.

25、Pote ntiala nu.can cerage nts.:lsolatio nof8.n ewsimaroubolide,6tigloy loxychaparri non e,fromAila nthusi ntegrifoliassp.calyci na (Simaroubaceae).LIoydia,1978,41:584-587. 36Polo nskyJ,Varo nZ,M orettiC,eta1.Thea ntin eoplastic quass ino idsofSimabacuspidateSprucea ndAila nthusgr disPr Mn.JN atProd,

26、1980,43:503509. 37ONeillM,BrayDH,Boardma nP,eta1.Pla ntsassourcesof an timalarialdrugs:/nvitroa ntimalarialactivitiesofsome quassi noids.A ntimicrobAge nChemother,1986,30:10 104. 38Oku nadeAL,BikoffRE,CasperSJ,eta1.A ntiplasmodiala tivityofextractsa ndquassi no idsisolatedfromseedli ngsof Aila nthus

27、altissima(Simaroubaceae).PhytotherRes,2003, 17:675677. 39OhmotoT,S ungY I.A ntimycoticsubsta nces in thecrude drugsII.ShoyalmgakuZasshi,1982,36:307- 314 40Merge nF.Atoxicpri nciplei ntheleavesofAila nthus.Bot Gaz,1959,121:32-36. 41H nLJ,PeiserGYi ngBP,eta1de ntificatio nofpla ntgrowth in hibitorypri

28、 nciplesi nAila nthusahissimaa ndCastelatortu osa.J如 cFoodChem,1995,43:1701711. 42DeFeeVDeMarti noL,Sa ntoroA,eta1.A ntiproliferative effectsoftree of-heave n（ Aila nthusaltissimaSwi ngle）. totherRes,2005,3:226-230. 43TsaoR,Roma nchukFE,Peterso nCJ,eta1.Pla ntgrowthreg ulatoryeffecta ndin secticidalactivityoftheextractsofthe treeofHeave n（ Aila nthusaltissimaLJ.BMCEcology, 2002,2:1. 44ShenJG沈建国）.BiologicalActivityofMedicinalPlantson Pla ntVirusa ndThreefectorl nsects.Fuzhou:Fujia nAi cultureandForestryUniversity（福建农林大学）,PhD. 2005. 45Rahma nS,FukamiyaN,Oka no M,eta1.A n