微生物检验方法的控制技术

1、微生物检验方法的控制技术微生物检验方法的控制技术 吉林出入境检验检疫局技术中心 罗雁非 摘要：为了更好地加强微生物检验工作中的质量控制 和质量保证，我实验室选用两种不同的方法来控制沙 门氏菌的检测，来保证检验方法的实效性、特异性、 可靠性和准确性。对样品进行沙门氏菌的检测和样品 中添加沙门氏菌标准菌株后的检测，来确认方法的等 同性。结果表明，选定的两种不同方法对两种沙门氏 菌标准菌株的检测完全一致，说明两种不同的方法的 等效性。并阐述了检测方法的标准操作规范（sop）， 来培养良好的实验室操作（glp）和良好的测量操作 （gmp）。 一、确定实验方法的目的和意义 随着我国入世步伐的加快，国际和

2、地区间的交流日益广 泛，如何提高检验检疫数据的准确性和可靠性以及实验室如 何采取有效的质量保证措施，保证检验结果的准确性和可靠 性，愈来愈呈现得重要。质量控制是保证实验室质量的手段 之一，其定义：为保证实验室得到的数据的准确和精确在已 知的概率限度内所采取的那些措施。保证报告和数据的质量， 就是实验室质量保证的目的和目标。影响报告和数据质量的 因素有：数据本身的质量、方法有关的质量、分析体系的质 量。据资料报道，我国对微生物实验室进行了全面的质量控 制已有20年的历史，多年来人们强调质量控制和质量评价， 人们越来越清楚地认识到质量控制是真正提高检验质量，保 证检验结果的准确性和可靠性。而检验是

3、我们工作和调查的 基础，检测质量控制也成为我们工作中需要重视的问题，甚 至是我们检验工作者必须认真讨论的问题。 检测结果不仅需要依赖实验室的仪器、标准菌株以及操作 人员的技术水平等诸多因素，要保证数据的准确和可靠要有 一种标准方法来实施，这是我们工作的基础，今天要着重讨 论的这个问题。 标准方法是权威机构对某项测试所作的同意规定的技术 准则和各个方面共同遵守的技术依据。也是应以满足用户提 出质量要求为最终目的并为保证结果的重复性、再现性和准 确性。 微生物的种类很多，不同类的微生物的生理特性不同， 用于检测和验证的微生物试验是具有挑战性和广泛性的，至 少要包括g+菌、g+菌、酵母菌和霉菌类的微

4、生物。这几类 微生物基本包含了样品中可能存在的各类微生物，另一方面， 他们也基本包含了样品中可能存在防腐剂抑菌效果检查试验 中所要使用的实验菌株。 在选择试验方法，必须根据以下几个特点来选择： 1.准确性要好； 2.精确，很少离散； 3.特异性好，对样品中其他成分没有依赖或干扰； 4.实用性好，使用的范围广和适应性宽； 5.可靠性、耐受性、再现性好； 6.灵敏性好； 7.检查所受的限制少。 二、实验方法的验证二、实验方法的验证 方法选定以后，就是要用现行的方法来验证方法的可行性，必 须通过外界组织和实验室自身来验证，其目的是为了获得、 改进、发展、测试试验方法的统一，正确地进行食品分析。 其可

5、达到的目的： 1. 方法由资深化验员使用，可达到预想的精度和准度。精度 是来衡量波动的，精度是实际样品分析的准确程度的。 2. 方法的实用性，简单、快速、可靠。 3. 可用性。 微生物的制备和培养决定着细胞的生理状况，而这些 生理状况接影响到微生物的测试结果，只有群体细胞均匀， 试验结果才能稳定。 此外，还有需要实际考虑的方面：快速性、经济性、 简便程序和客户要求等等。还有出口商品微生物鉴定时， 基于这一点，微生物实验室应该对出口国的同种类型食品 采用不同种方法，必须考虑食品被出口国所使用的具体分 析方法。 列如：根据国家质检总局质检食函2004273号文件的 要求，我国对禽肉中沙门氏菌的检测

6、方法要与美国usda或 fda现行方法等效，我局微生物实验室尽快采用iso 6579： 2002-07-15方法进行了对方法的验证。 sn方法方法：以无菌方式进行多点取样25g+225ml缓冲蛋白 胨水，经37水浴4h培养，进行非选择性增菌；确保濒 于死亡的细菌进行复活。其后移取10ml转种于盛有 100ml四硫磺酸盐煌绿增菌液，经421培养202h， 进行选择性的增菌；使目的菌优胜出来。将增菌液摇匀， 以无菌操作，分别接种dhl和bs平板上于37培养 242h，进行分离培养；使目的菌分离出来。观察每个 平板上的菌落，选取3-5个菌落接种于tsi或尿素酶琼脂 上，于37中培养242h，进行筛选

7、试验；将符合沙门 氏菌特征的tsi中的培养物，接种于营养琼脂平板上， 37中培养242h，进行纯化培养；选取单个菌落，接 种于20e微量生化管中，进行api生化鉴定；同时取单 个菌落，在洁净的玻板上，作血清学鉴定。 iso方法：方法：以无菌方式进行多点取样（有代表性的并完好 无损）25g+225ml缓冲蛋白胨水，经37孵育182h，进 行非选择性增菌；其后移取0.1ml培养液接种到含有10ml rsv的试管中，经41.51培养243h，另取1ml接种到 含有10mlmkttn的试管中，经371培养203h，进行 选择性的增菌。将两种增菌液摇匀，以无菌操作，分别接 种两种选择性平板，xld和dh

8、l或bs平板，于37培养 243h，进行分离培养；观察每个平板上的菌落，选取2- 5个菌落接种于tsi或尿素琼脂上，于37中培养242h， 进行筛选试验；将符合沙门氏菌特征的tsi中的培养物， 接种于营养琼脂平板上，37中培养242h，进行纯化培 养；选取单个菌落，接种于20e微量生化管中，进行api 生化鉴定；同时取单个菌落，在洁净的玻板上，作血清学 鉴定。 我们采用的样品是由吉林德大有限公司提供的出口的 熟禽肉制品，经过加工处理后，再经过检测，并用上 述两种方法进行确认无沙门氏菌存在，在其中添加两 种标准沙门氏菌菌株50013和50041再用上述两种方法 进行检测和确认，其检测结果见表1，

9、 表1 样品号采用方法 检测样品 的数量 阳性样品 的数量 阳性样品 的百分比 （%） 采用的标 准菌株号 备注 1-25sn 25 0 0 26-50 iso 25 0 0 1-25 sn 25 0 0 26-50 iso 25 0 0 1-25 sn 25 0 0 50041 添加的标 准菌株 26-50 iso 25 25100 50041 添加的标 准菌株 1-25 sn 25 00 50071 添加的标 准菌株 26-50 iso 25 25100 50071 添加的标 准菌株 结果分析，从表中可以看出，用sn 0172-1992和iso 6579：2002-07-15两种方法对沙门

10、氏菌的检测的结果完 全一致，在无沙门氏菌的情况下，检测结果是一致的， 在不同样品添加标准菌株检测的结果仍然是相同的。得 出结论是sn 0172-1992和iso 6579：2002-07-15两种方法 对沙门氏菌的检测是等效的。 我们实验室的我们实验室的sop： 沙门氏菌是肠杆菌科中的一个重要的菌属，是最常见的食 源性细菌病原体。近几年来已经发现近2000个血清型。年 幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等视为易感人群。 沙门氏菌的污染源主要是人和家畜的粪便，沙门氏菌常存 在于动物中，特别是禽类和猪，从水、土壤、昆虫中；从 工厂生产车间的表面和动物粪便中已发现该类细菌。生肉， 禽肉及其制品，奶

11、制品和蛋，鱼，虾和田鸡腿，酵母，椰 子、酱油和沙拉调料，蛋糕粉，奶油夹心甜点，顶端配料， 干明胶，花生露，橙汁，可可和巧克力以及供动物的饲料 等均可被沙门氏菌污染。 我国现行检测沙门氏菌的标准主要为：“sn 0172- 1992 出口食品中沙门氏菌属（包括亚利桑那菌）检验 方法”和“gb/t 4789.4-2003 沙门氏菌检测”，但以上 方法与美国农业部的检测方法（usda fsis mlg 4.02 in microbiology laboratory guidebook, 3rd 1998）在样品 制备、目标菌的分离鉴定等方面存在很大的区别，为完 善实验室的检测方法体系，为使操作人员完全

12、按照标准 程序进行操作，满足客户的特殊检测要求，特参考采用 美国农业部的检测方法，制定本标准操作程序。 在保证操作人员的健康的前提下，本标准操作程序 详细描述了检测各类肉类、肉制品、蛋、蛋制品及环境 中漂洗液样品中沙门氏菌的方法。本标准操作程序的最 低检测限是25g样品中含有至少一个菌。使用本标准操 作程序检出的菌株菌需用生化试验和血清学方法进行确 认。 吉林出入境检验检疫局技术中心生物检测实验室的 所有承担食源致病微生物检测的人员必须按照本标准 操作程序进行各类肉类、肉制品、蛋、蛋制品及环境 中漂洗液样品中沙门氏菌的检测工作。 沙门氏菌为肠道传染病的病原体。实验室的工作 人员必须遵守spsc

13、mot008中关于二级生物安全防护 的要求。为保证操作人员的身体健康，作好防范工作， 易被其感染的年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺 陷者必须远离进行沙门氏菌分离、鉴定和确认的实验 室。 生物安全柜ii级的高效过滤网被用来防止致病菌引 起的气溶胶。 口罩、手套和眼罩的保护是必须的并且所有的工作 区的表面在工作前后必须马上消毒或进行一次性的无 害化处理。所有的代谢物，要经过高压灭菌无害化处 理，来保证人员和环境的不污染。 检测所用培养基、化学试剂以及微生物的生产商必 须提高提供相关的有效的安全数据。 在所有检测过程中至少包含三种控制方法，即包 括h2s阴性沙门氏菌、h2s阳性沙门氏菌和培养基空白

14、 对照。质控菌株需要接种到肉或正在分析的肉中。在 相同的条件下同样的程序同时分析质控样品于样品待 验样品。确保从每个阳性控制样品中能检出至少一个 菌落。 在生化试验和血清学试验需要使用适当的对照来证实 结果的正确性。 在本标准操作程序实施过程中的阳性质控菌株为两株 沙门氏菌（atcc 50013和atcc 50041）和一株亚利桑 那菌株（atcc 47001），阴性质控菌株为一株枸橼酸 盐杆菌（atcc 48001）、大肠艾希氏菌（atcc 63301）。 一旦估计待检样品为沙门氏菌阴性，合并样品可以 节省时间、人力和物力。有好几种合并样品的方法。如 果估计检出沙门氏菌的可能性很高，或如果已

15、检出阳性 菌株，但没有必要知道其被污染的具体样品时，在非选 择性前增菌时合并样品是合适的。 在选择性平板中各选取2-3个可疑菌落，（避免接触到琼 脂，因为这些强选择性琼脂培养基会抑制许多微生物的生长， 如果在平板上有典型的菌落，但没有很好的分离纯化，应选 择典型的菌落直接重新在选择性平板上接种划线。或者用接 种环挑取生长物接种到试管装的ttb，然后重新在选择性平 板上划线。）接种于tsi、赖氨酸脱羧酶琼脂、或尿素酶琼脂 上，于37中培养242h，记录高层和斜面的颜色、培养基 变黑、有气泡或培养基开裂显示产气以及斜面划线处的菌落 生长。检查直立培养的tsi和u 琼脂。丢弃或重新划线分离任 何最初培养时生长过于密集的试管。丢弃所有在u琼脂斜面 上显红色的试管。分离显示典型沙门氏菌翻译感的菌株，检 疫分离沙门氏菌反应不典型的菌株，需要结合生化试验和血 清学试验进行确认。动力试验是非强制