GST亲和层析介质使用说明书(20210408234447)

1、GST亲和层析介质使用说明书 一、简介 GST亲和层析介质（GST Agarose）是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及 与谷胱甘肽有 亲和作用蛋白的分离介质，一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白 的活性。 本产品是自主设计合成的GST琼脂糖凝胶，具有优良的物理和化学稳定性，使用寿命长，操作方便，批次重复性好，易于放大，是 研发与生产的理想选择。 性能参数 特点 基团密度高，载量大 基质 6%勺交联琼脂糖凝胶 吸附载量 绍 5mg GST 融合蛋白（55kDa） /ml 介质平均粒径 100 ; _m 最大流速 300c

2、m/h pH范围 3、10,在位清洗时pH范围可到2-11 使用温度 常温 保存温度 +48 C 保存液体 20%!醇 化学稳定性 室温下可在0. 1M柠檬酸（pH 4.0） , 0. 1 M NaOH 70%!醇或6M盐酸弧中耐受2h, 蛋白结合能力不受影响 适用范伟1 分离谷胱甘肽S-转移酶（GST融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白。 四、操作说明 1. 缓冲液配制 缓冲液 A （平衡缓冲液）：10mM NaHPQ 1. KHPO, 140mM NaC, 2. 7mM KCI,调节 pH 值至 8.0。 缓冲液B （洗脱缓冲液）：10mM Glutathione （

3、还原型）,50mM Tris-HC1,调节pH值至8.0。因Glutathione易 氧化, 需现用现配。 （注：各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理， 0.45叩滤膜过滤备用）。 2. 样品预处理： 600w功率,每循环超声3s,冷却3s,循环99X3 按每克湿重菌体/25ml平衡缓冲液的比例充分悬浮离心收集的菌体; 次，破碎菌体;4C、15000rpm离心15m,收集上清液,或用0. 45呵滤膜过滤。 3. 装柱： 聚苯乙烯层析柱 1）将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下 方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫

4、片下方滞留气泡。 2）打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片11.5cm高度时封闭下端出口，用移液枪按需要量吸取介 质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min,让介质自然沉降。 3）从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫片与介质接触面滞留气泡（如对实验 结果要求不严，也可不放入上垫片，以提高流速）。 4）在使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可先用小锡子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，倒出介质，清洗或更换新的垫片后， 按2）、3）所述 玻璃层析柱 1）将层析柱洗净后垂直固定到铁架台上；向柱中加入蒸镭水，排开柱子中的空气，在

5、蒸饰水排尽以前，关闭柱子出口， 在柱内保留58cm高度的蒸镭水。 2）先将介质混匀，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min, 让介质自然沉降。 3）从上端管口将转换杆出液端缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免转换杆与介质接触面间滞留气泡。 4）在使用一段时间后，如果流速减慢，可先卸下上转换杆，将介质倒出，再取出下转换接头中滤网，清洗或更换后重新装柱。 4. 过柱： 1）用10倍介质体积缓冲液A过柱，平衡介质； 2）上样； 3）用510倍介质体积缓冲液A过柱，洗去层析柱中剩余上样液并重新平衡介质; 4）用5、10倍介质体积缓冲

6、液B洗脱，收集洗脱液; 5) 用5、10倍介质体积缓冲液A重新平衡介质。 注：纯化过程流速不宜过快，对于 1ml介质，流速保持在0. 5ml/min为宜。 5. 介质清洗 如果在使用一段时间后，介质因表面沉积过多杂质导致蛋白结合能力下降，需对介质进行清洗。步骤如下： 1) 沉淀或变性物质的清洗： 用2倍介质体积6M盐酸弧清洗，然后用5倍介质体积缓冲液A平衡介质。 2) 疏水缔合物质的清洗： 用34倍介质体积70%乙醇(或2倍介质体积去垢剂，如 1% Triton ? X-100)清洗介质；然后用5倍介质体积缓冲液 A平衡介质。 6. 介质再生 每次层析前，为达到最佳纯化效果，需对介质进行再生，

7、步骤如下： 1) 2 倍介质体积高 pH 缓冲液(0. IM Tris-HCI, 0. 5M NaCI, PH8. 5)和低 pH 缓冲液(0. IM sodium acetate, 0. 5M NaCI, PH4.5 )交替洗脱三次。 2) 10倍介质体积缓冲液A平衡介质。 7. SDS-PAG 检测： 1)不同浓度SDS-PAG分离胶分离范围 分离胶浓度 分离范围 6% 50-150kD 8% 3090kD 10% 2080kD 12% 1260kD 15% 1040kD 2) SDS-PAG操作流程 A. 每个胶孔最适蛋白上样量为 5、10gg B. 将含510gg蛋白的样品溶液与loa

8、ding buffer混匀，90 C孵育5min,取出后5000rpm离心1 min C.上样，15mA 30mA恒流或80V、120V恒压电泳。 8. 介质保存 4 C8 C条件下，介质可长期保存于20%乙醇中。 五、GST Agarose分离GST融合蛋白实例 层析介质：GST lm；对照GST介质（国际领先品牌）lml 样品：表达可溶性GST-tag融合thioredoxin的大肠杆菌BL21裂解液 结合缓冲液：lOmM Na：HP0, 1. 8mM KHcPO-, ,140mM NaC, 1 2. 7mM KC1, pH 8. 0 洗脱缓冲液：10 mM Glutathione （还原

9、型），50 mM Tris-HCl, PH8. 0 流速：GST lml, 0. 5ml/min ;对照 GST 介质 lml, 0. 5ml/min 实验结果： 色谱分析结果见图1,色谱各组分的SDS-PAGE吉果见图20 图1 GST Agarose分离GST融合蛋白色谱图 1. 低分子量Marker； 2.上样液； 3. GST-流穿液；4. GST-洗脱液； 5. 对照-流穿液；6.对照-洗脱液 12 3456 图2纯化后SDS-PAGEO 六、GST亲和层析介质使用注意事项 1. GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为获得最大结合量，需要保证足够的作用时间，因而在上样时要

10、可以先把介 维持较低流速。在样品中加入510mMDTT可以增加介质对目标蛋白的吸附。对于按常规步骤操作吸附效果不好的样品, 2. 不同的GST融合蛋白取得最佳纯化效果所需还原型谷胱甘肽浓度、洗脱体积和洗脱时间可能有所不同。必要时需对流穿液、洗 脱液进行SDS-PAGE以及Western杂交分析，以确定最佳纯化条件。 3. GST融合蛋白以包涵体形式存在时不能与介质结合，必须先进行变性、复性、透析处理后才能用介质进行纯化。纯化效果取决于 复性效率。 4. 纯化后出现杂带的常见原因 1) 目标蛋白断裂或酶解 解决方案：向缓冲液A和缓冲液B中加入ImMPMSF抑制蛋白酶活性，或0. 1 %Trito

11、nX-100或0. 1 % Tween-20等稳定剂。 2) GST融合蛋白不完全表达 GST融合蛋白有时候只表达到GST部分就终止，GST标签蛋白连同完全表达的融合蛋白均能与介质结合并被洗脱下来， 因而洗脱液中出现26KD左右的杂带。 解决方案：尝试用不同浓度的还原型谷胱甘肽洗脱；优化表达条件，降低GST融合蛋白不完全表达量；改变外源基因在 载体中插入的酶切位点，重新构建表达载体；在不改变外源基因两端酶切位点的情况下，更换通用载体。 5. 如后续实验需要除去洗脱液中还原型谷胱甘肽，可采用超滤或透析的方法。 七、GST标签切除 GST标签可用位点专一的蛋白酶如凝血酶或Xa因子从融合蛋白中切除。蛋白酶解后，再用GST亲和层析方法去除GST标 签，目标蛋白存在于流出液中。一般情况下，与