食品中致病菌的初筛鉴定和污染源的追溯

1、张志坤 2009.3.10 一一. .概述概述 二二. .致病菌的初筛及鉴定系统致病菌的初筛及鉴定系统 (一).目前食品安检中致病菌常规的检测方法 (二).常规检测方法的优缺点 (三).食品微生物检测的发展趋势 (四).分子生物学理论基础 (五).分子生物学检测技术-pcr技术和real-time pcr技术详解 (六).分子生物学检测技术-生物芯片技术（探针技术）简介 (七).分子生物学检测技术的优缺点 (八).分子生物学鉴定技术简介 三三. .致病菌污染源的追溯系统致病菌污染源的追溯系统 (一).概述 (二).目前常用的污染源追溯方法-pfge电泳方法简介 (三).dupont公司ribo

2、printer system简介 微生物检测 常规微生物检测 致病微生物检测 常规微生物项目：细菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、酵母总数、霉菌总数，此 类细菌不致病，但会严重影响食品的外观及风味。目前常用 微生物培养法来计数菌落，允许有该类菌落，但菌落总数不 能超标。 致病微生物项目：沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌o157： h7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞 菌等。致病微生物在食品中是绝对不允许存在的，所以快速 检测食品中是否存在有致病微生物，是食品安全检验的重中 之重。下面我们重点来谈一下致病菌的检验方法。 食品微生物检测 食品中致病微生物的检测 致病微生物检

3、测致病微生物检出及鉴定污染源的追溯 为什么要进行污染源的追溯? 1.可以搞清楚致病菌污染的源头,进而分析出污染爆发的原因; 2.可以更为有效地消除污染源,杜绝污染的再次爆发; 3.在食品生产的各个环节可以有效地进行质控. 收集样品无选择性富集细菌（4-8小时） 选择性的富集增菌（18-24小时） 1.平板培养纯化细菌，根 据菌落形态，生理生化 特征等检测。 2.免疫检测 收集样品富集细菌选择增菌 培养检测 免疫检测 (一). 2种显色底物用来显示2种阪崎肠杆菌的特异性酶活性：-d-吡喃葡萄糖苷酶glucopyranosidase and -d-纤维二糖酶,并可以检测低活性的-d吡喃葡萄糖苷酶菌

4、株。抗生素用来抑制大多数革兰 氏阳性菌、酵母菌和一些革兰氏阴性菌的生长 24小时培养后获得典型的菌落（蓝灰色到蓝黑色），48小时培养后出现特有的菌落形态。因此可以 在48小时一次判读结果。 35-37c和 41.5c培养均通过评估，通过评估可在mlst新生霉素或ee肉汤增菌培养后使用 (fda/cfsan:2002) 特异性: 3种显色底物能更好地选择性分离和区分 包括伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌和绝大多数 乳糖阳性地沙门氏菌在内的沙门氏菌。 营养成份: 在强选择性成分作用下，沙门氏菌经过 37 c 18-24小时培养形成较大、边缘不规则、 显色明显的菌落。 选择性: 强选择性确保抑制污染食物

5、的其它菌落如：革兰阳性球菌、酵母菌和大部分非发酵革兰阴 性细菌。 (一). 葡菌肠毒素是引起食物中毒的常见原因。 7种不同的血清型可被鉴定。这些毒素蛋白最初仅由金黄色 葡萄球菌产生，但目前有报道中间型葡萄球菌和猪葡萄球菌也能产生毒素。尽管葡萄球菌可通过加热 破坏，但这些毒素是热稳定性的，可在高温下存活。 生物梅里埃采用尖端科技的elfa技术，运用能更好的捕获抗原的新抗体 工作。移去粘附在酶结合抗体上的fc片断，明显增强了试剂盒的性能。 移去fc片断减少了可能产生潜在错误信号干扰的食物成份和非特异性结 合的其它细菌，提高了特异性。释放2个小的fab片断优化了抗体的位置， 更好地结合抗原，提高了敏

6、感性.vidas set2是一个由包含成品试剂和spr （固项容器）管组成的单剂量试剂。 vidas全自动仪器进行整个检测步骤并打印结果：阳性或阴性 检测食品中的葡萄球菌毒素 检测时间: 80 分钟 整个检测周期: 少于1天 (一). (1).直观 由于常规检测方法是用微生物的培养法来进行的，所以此类方法很直观，经过一定时间的培养后，进 行菌落形态和细菌形态及细菌生理生化的鉴定，有没有一目了然，非常直观。 (2).经济 由于常规方法不需要特殊的试剂，显色培养基和普通染色镜检即可完成检验和鉴定，所以成本低廉。 (1).周期长 由于常规检测用的是微生物的培养法，需要不断的选择性培养纯化，再加上生理

7、生化的鉴定，周期非 常长（一周左右）。 (2).不能准确鉴定变种致病菌 打个比方，常规的鉴定方法就像鉴定一个人一样，先看人群的形态（物以类聚，人以群分，类似于菌 落形态），再看此人穿什么样的衣服（类似于有无鞭毛和荚膜），接下来看此人的外貌（有无特殊的标 志，类似于细菌的形态学观察），最后看此人的习惯（类似于细菌的生理生化特点，遇染色培养基变色 等）。但是细菌的变异率是非常高的，遇见变异的致病菌和未知的致病菌，我们往往会束手无策，常常 会得出是是而非的结论。 这是任何一种检测方法的基本要求，其他有点要在此基础上建立。对于变异的致病菌和未知的细菌 也要能准确无误的做出鉴定。 在准确的基础上，能够快

8、速得出检测的结果，以减轻仓储和物流的压力，达到快速出货加快产品流 通的目的。 在微生物的检测中，样品间的交叉污染是个让人十分头疼的问题，好的检测方法应该能有效的避免 交叉污染的发生。 检测成本不能太高，尽量减少企业的检验成本。 随着我国加入世贸组织，国内企业越来越多的产品走向了世界，但其他国家为了保护本国企业的利 益，往往会在检验标准上设置贸易壁垒，所以这就要求我们的检验标准和国际检验标准接轨，这样才能 顺利的把我们的产品销往国外。 基因决定着生物的种类和性状。大千世界，各种生物千姿百态，这一切皆源于各种生物所携带基因的 差异。随着科技的不断发展，人们认识物种的水平已经从形态及生理生化水平进入

9、到了基因水平。举个 例子来说，门，纲，目，科，属，种，亚种，人类都是属于同一个种-人种，人种又可分为黄，白， 黑，棕等亚种；就拿黄种人来说吧，不同的生物，其基因也是不同的，这就是dna鉴定的理论基础。 在致病菌的检验上，我们同样可以用dna-这个基因的载体来进行检验和鉴定。 基因是一段核酸序列，用来编码特定的氨基酸序列，和指导蛋白质合成及加工，从而使生物体具有 特殊的性状。核酸经水解可得到很多核苷酸，因此核苷酸是核酸的基本单位。核酸就是由很多单核苷酸 聚合形成的多聚核苷酸。核苷酸可被水解产生核苷和磷酸，核苷还可再进一步水解，产生戊糖和含氮碱 基。核苷酸中的碱基均为含氮杂环化合物，它们分别属于嘌

10、呤衍生物和嘧啶衍生物。核苷酸中的嘌呤碱 (purine)主要是鸟嘌呤(guanine,g)和腺嘌呤(adenine,a)；嘧啶碱(pyrimidine)主要是胞嘧啶 (cytosine,c)、尿嘧啶(uracil,u)和胸腺嘧啶(thymine,t)。dna和rna都含有鸟嘌呤(g)、腺嘌呤(a)和 胞嘧啶(c)；胸腺嘧啶(t)一般而言只存在于dna中，不存在于rna中；而尿嘧啶(u)只存在于rna中，不存 在于dna中。 核酸 脱氧核糖核酸（dna）,其戊糖环为脱氧戊糖 核糖核酸 （rna）,戊糖环为非脱氧戊糖 水解水解 1.1.核酸链一般都是以双链存在的，尤其是核酸链一般都是以双链存在的，

11、尤其是dnadna链。两条链之间以碱基所形成的氢键连接，形成双螺链。两条链之间以碱基所形成的氢键连接，形成双螺 旋旋 结构。碱基之间的连接是有严格的配对原则的即结构。碱基之间的连接是有严格的配对原则的即: :a-t;g-ca-t;g-c。如下图：。如下图： 1.1.核酸链一般都是以双链存在的，尤其是核酸链一般都是以双链存在的，尤其是dnadna链。两条链之间以碱基所形成的氢键连接，形成双螺旋链。两条链之间以碱基所形成的氢键连接，形成双螺旋 结构。碱基之间的连接是有严格的配对原则的即结构。碱基之间的连接是有严格的配对原则的即: :a-t;g-ca-t;g-c。如下图：。如下图： 2.核酸的变性，

12、复性和杂交 dna双链之间以氢键连接，氢键是一种次级键，能量较低，易受破坏，在某些理化因素作用下，dna 分子互补碱基对之间的氢键断裂，使dna双螺旋结构松散，变成单链，即为dna变性。dna变性只涉 及二级结构改变，不伴随一级共价键的断裂。dna的变性从开始到解链完全，是在一个相当窄的温 度内完成的，在这一范围内，紫外光吸收值增加达到最大增加值的50时的温度叫做dna的解链温 度（tm）。一种dna分子的 tm值的大小与其所含碱基中的 gc的比例相关也与dna分子大小及变性 条件有关，g+c的比例越高，dna分子越长，溶液离子强度越高，tm值越大。加热、低盐及强酸、 强碱均可使dna变性。

13、2.复性 变性dna在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，这种现象称为复性。热变性的 dna经缓慢冷却后即可复性，这一过程也叫退火，一般认为，比tm值低 25 的温度是dna复性的最 佳条件。 3.dna复性的实际应用杂交：通过变性dna的复性性质，我们可知道，dna单链之间、rna单链之 间、一条dna和一条rna链之间只要存在序列互补配对区域，不管是整条链互补，还是部分序列互补， 即可重新形成整条双链或部分双链，这即为核酸分子杂交，这在分子生物学研究中有极大的应用， 比如：可用于在基因组中对特异基因的定位及检测，pcr技术扩增目的基因等，很多分子生物学实 验技术应用的都是核酸

14、分子杂交的原理，如southern blot, northern blot,这个性质也是pcr的理 论基础。 2.核酸的变性，复性和杂交 变性复性杂交 聚合酶链锁反应，polymerase chain reaction，简称pcr，pcr这项技术是由凯利穆利斯(kary mullis) 发明，并因此在七年之后，1993年10月，获得了诺贝尔化学奖该项殊荣。穆利斯的想法是，利用一种人 工方法，和反覆相同程序的方法，并利用一种特殊的酶即dna聚合酶来扩增特定的dna片段。 dna聚合酶天然存在于生物体内，在细胞分裂前进行dna的复制。当dna开始复制时，解旋酶将双股的dna 分开成两个单股。dna

15、聚合酶便结合在两dna单股链上，生成互补链。在穆利斯最初的pcr反应中，将dna 聚合酶用于体外试验。双链dna被加热到96，使得双链分离成为两条单链。但是在这个温度下，dna聚 合酶被破坏，因此在每个循环的加热步骤后必须补充新的聚合酶。穆利斯的原始pcr反应效率极低，需 要大量时间和dna聚合酶，并且在整个pcr反应中都需要人来照看。 后来，由嗜热细菌水生栖热菌(thermus aquaticus)体内产生的dna聚合酶改善了这种低效的pcr反应。 由于嗜热细菌生活在温度超过110的间歇泉中，它的dna聚合酶具有耐热性。在用于pcr反应时，高温 并不能破坏这种dna聚合酶，因此不需要不断加入

16、新的聚合酶，pcr反应由此变得简单并且可以由机器操 作。 最初的具有耐热性的dna聚合酶来自于水生栖热菌(thermus aquaticus)，因此被称为taq。taq酶被广泛 用于当前的pcr操作中。taq酶的缺点是它缺少3-5校正外切酶活性，因此在复制dna时有时会出错， 造成dna序列突变(错误)。从古菌中获得的pwo酶及pfu酶均有校正机制，能够大大降低pcr反应中的突变。 将taq与pfu结合使用可以保证真实准确得扩增dna pcr用于扩增一小段已知的dna片断，可能是单个基因，或者仅仅是某个基因的一部分。与活体生物 不同的是，pcr只能复制很短的dna片断，通常不超过10kbp。d

17、na是双链分子，因此用互补dna双链的构造 单位(核苷酸)来度量其大小，单位为碱基对（base pair, bp）。某些特定的方法可以扩增40kbp左右的 片断，但是这种大小与真核细胞的染色体dna相比仍然是很少的。例如，人的体细胞dna含有大约30亿个 碱基对。 目前应用的pcr反应需要几个基本组成： （1）.dna模板（template），含有需要扩增的dna片断。 （2）.2个引物（primer），决定了需要扩增的起始和终止位置。（见下面引物一节） （3）.dna聚合酶（polymerase），复制需要扩增的区域。 （4）.脱氧单核苷酸（dntp），用于构造新的互补链。 （5）.缓冲体系

18、，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。 pcr反应在热循环设备中进行。pcr仪可以将反应管加热或冷却到每步反应所需的精确的温度。为防止反 应体系中液体蒸发，通常在反应管上加盖加热的盖子，或者在反应体系表面加入一层石蜡油。 一般的pcr反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下4个步骤： (1).利用高温(93-98)使双链dna分离(熔解)。高温将连接两条dna链的氢键打断。在第一个循环之 前，通常加热长一些时间以确保模板和引物完全分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分 钟。 (2).在dna双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链dna上(降温或称接合)。此阶段的温度通 常低于引子熔点

19、5。错误的黏合温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间 1-2分钟。新技术的融合型核酸聚合酶在此阶段的温度会高于熔点35，仅需时间510秒。 (3).最后，dna聚合酶由降温时结合上的引子开始沿着dna链合成互补链(延长)。此阶段的温度依赖 于dna聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的dna片断长度。传统的taq估计合成 1000bp大概需要1分钟、较新的tbr(来自于嗜热菌thermus brockianus)约40秒、融合型聚合酶 仅约15秒。 (4).琼脂糖电泳检测pcr产物,主要是片段大小。 pcr简图 (1) 96高温下使双股 dna打开 (2) 在约68下让引

20、物与 dna配对 (3) 在72 dna延长 (p= 聚合酶). (4) 第一循环完成，做出 的两段双股dna又可 当作下一个循环模板， 这样每次循环都使得 扩增的dna片段加倍。 (5).经过20-40轮的pcr反 应，目的基因被放大 了上百万倍。 琼脂糖凝胶电泳 经过20-35轮的扩增后， 特异的目 的基因（代表该微生 物）被放大 了近百万倍，将pcr所 得的产物进 行凝胶电泳，根据标 准dna分子量 marker进行比对，得 出pcr扩增有 没有得到目的基因， 进而推断出 待检物中有没有该基 因（该微生物）。 每种致病菌的引物和特异基因都是该试剂公司经过长期研究和并反复试验准确无误的，尤

21、其是拿 到了国际或国家检验标准认证的公司。 pcr检验不需要选择性增菌，只需简单富集一下，即可进行pcr检验。一次可检测96384个样品 （大型pcr检测的样品还可以更多）。一般24小时之内出结果。 由于普通pcr的检验是在一个开放的系统中进行的，所以容易形成样品间的交叉污染。现在国家 已经明令禁止在医院检验系统采用普通pcr检验。 实时荧光定量实时荧光定量pcrpcr（real-time pcrreal-time pcr）的出现有效地解决了上述的问题，并）的出现有效地解决了上述的问题，并 成为了现在医院检测传染性疾病（肝炎，性病，细菌感染）的首先。在食品成为了现在医院检测传染性疾病（肝炎，性

22、病，细菌感染）的首先。在食品 微生物安检领域，美国微生物安检领域，美国dupontdupont公司研发的公司研发的baxbax系统已获系统已获aoacaoac的认证，并被多的认证，并被多 个国家所采纳，个国家所采纳，20072007年年7 7月月9 9日被我国作为官方标准用于食品的检验，北京奥日被我国作为官方标准用于食品的检验，北京奥 运会期间作为被用于奥运会食品安检。运会期间作为被用于奥运会食品安检。 实时荧光定量pcr技术于1996年由美国applied biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了pcr 从定性到定量的飞跃，而且与常规pcr相比，它具有特异性更强、有效解决pcr污染

23、问题、自动化程 度高等特点，目前已得到广泛应用。 实时荧光定量pcr：在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程， 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 定量pcr仪是在普通pcr仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，pcr扩增和检测同时进 行，最终结果不需进行电泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。 常 规 pcr技术：对pcr扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无 法对扩增反应实时检测。 实时定量pcr技术：利用荧光信号的变化实时检测pcr扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化， 通过ct值和标准曲线的分析对起始模板进

24、行定量分析 每个循环进行一次荧光信号的收集 sybr greensybr green 53 53 sg no emission sgsg sgexcitatiexcitati onon s g s g s g s g s g s g s g 53 53 emissi on excitatiexcitati onon 伴随着每轮pcr的进行，特异的基因片段不断积累，sybr green不断的与新增加的基因片段结合 而发出荧光，荧光信号不断积累，荧光定量pcr仪实时记录了荧光信号的变化。 与目标序列互补 taqman探针的特性： (1).5端标记有报告基团(reporter, r) ，如fam、v

25、ic等 (2).3端标记有荧光淬灭基团 (quencher, q) (3).探针完整，r所发射的荧光能量被q基团吸收 ，无荧光， r与q分 开，发荧光 (4).taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针 每扩增一 条dna分子， 释放一个 荧光信号， 可以在循 环过程中 任一点检 测荧光 8.荧光定量pcr的数学原理 理想的pcr反应： x=x0*2n 非理想的pcr反应： x=x0* (1+ex)n n：扩增反应的循环次数 x：第n次循环后的产物量 x0：初始模板量 ex：扩增效率 在扩增产物达到阈值线时: xct=x0 (1+ex)ct =m (1) xct:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增

26、产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为m 方程式(1)两边同时取对数得: log m=log x0 (1+ex)ct (2) 整理方程式(2)得: log x0= - log(1+ex) *ct+ log m (3) loglog浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即ct值就可计算出样品中所含的模板量就可计算出样品中所含的模板量 模板dna量越多，荧光达到域值的循环数越少，即ct值越小 log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线， 根据样品ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 2

27、5 sample 上世纪上世纪90年代中页，从杜邦中心研发实验室发展出来年代中页，从杜邦中心研发实验室发展出来 outgrowth of dupont cr 2.可以更为有效地消除污染源,杜绝污染的再次爆发; 3.在食品生产的各个环节可以有效地进行质控. (一).概述 终产品致病菌的分离与纯化与分型原辅料及生产环节存在的致病菌的分离纯化与分型 终产品中致病菌各亚型与中间环节致病菌各亚型的比对找出污染的源头和原因 4.必须对致病菌进行亚型分析才能更为准确地找出污染源头 每一种致病菌都可分为各种不同的亚型,这就像人可以分为黄种人白种人和黑种人一 样,只有更为精细的分型才能更为有效的进行污染源的追溯

28、.所以污染源的追溯主要所以污染源的追溯主要 就是进行致病菌的亚型分析就是进行致病菌的亚型分析. . 3.污染源追溯的过程 (二).目前常用的致病菌污染源追溯方法 1.致病菌的免疫学分型法 以生物梅里埃为代表.用致病菌的不同亚型免疫动物以产生不同的抗体,再用 这些不同的抗体来鉴定致病菌不同的亚型.优点是速度快,但极易出现假阴性,尤其 是致病菌产生变异或其毒力基因表达和遗传成分不稳定时.目前已经很少被用来作 为致病菌污染源追溯了. 2.致病菌的表型分型法 biolog公司为代表，用致病菌不同亚型细微的形态差别和生理生化特性的不 同进行分型分析，优点是速度快，但极易出现假阳性和假阴性，而且分型时常常会 遇到似是而非的情况。目前基本不被用来做为致病菌的污染源追溯。 (二).目前常用的致病菌污染源追溯方法 3. pfge电泳方法简介 脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis, pfge)是一种非常有效的分子分型技 术,基本原理是通过电场的不断改变，使包埋在琼脂糖凝胶中的dna分子的泳动方向做相应改变， 小的dna分子比大的变化快，故小分子泳动得快，从而在凝胶上按染色体大小而呈现出电泳带 型。dna带的密度在一定程度上反映了细菌内dna的含量以及dna分子的大小，最终达到分型的目 的。pfge常用于基因组dn