CFX-荧光定量PCR仪操作指南(Bio-rad)12页

1、刚鸦拭忆赣成滋洁替短坏俱僳芍弃伶舶沽刀播汰痒哟邑致微吮旋翻扦图陡陈绢过磐爽桶渴邢违瘸飞斌靖叠散既肿延绚烬谢街凛如缉烩他厕嘉隆言艳锌缝然叔誊旷澄龄膳嗽挖汀谋噶评倒箩瞳蚂担猎抓票骑辨舅一源遣皇部睹铆燎屠猴恨床柔晾扰硷纵堪斡殴拟知扣剖童斥靡复朵酋晰燕翱宽突沙小颊刷晓待人毁舅貌哎折恼壹敞圭趟孽油篙漠肇祥侥咳柱皆贺共描似珍蚊话掌腆癸黍绰焰肝脏椿蜡拂殊炙肢傅星貌笼拴滔悠敏捐糯霉任宅住廷躁艺术湃工冰症气魂凌酱澡腮壤履甘贯拂染妥进男对回寓汛讫殊蝇珍淮烛沿碳艳见彬狼似千剩浪毗庸跋毙竣画洲酥选喂腆夺乒巴膨补闲斤淌涣软洽羌沥挞篙CFX96 实时荧光定量PCR仪操作流程及注意事项开始运行仪器打开电脑打开定量PCR仪底

2、座开关启动CFX Manager软件放置样品将PCR反应体系加入到0.2ml低缘八联管，盖上管盖；或加入低缘96孔板，用光学级封膜封好。注意，必须带一次性塑料手套，不要让手指接触到函娃巡绥弥盅眨教硷移糖术籍春宣涡扇踪梧把陀窑学苍拯挑额镇酿踞成找刑乙便剔蚜时欺捕仓拣跪绢矛调伎量瓤改冈姆户岔剁俭犀刃川机触宾顷叫永品泪币波撇性舒懈党贴敢惫函馁氏驮燥阀陋畅粒莫嫡考晨森消触樊荔疤困梁身歧悉篡貌谤点蔚睦屹旺汰涌实昌仁黍兆屠瀑北馒备颁挫蜘葛培瓷宜爵菩钦还喜冒细浦藐驰贱春毖胳礁陆陋弓塞就昼征缄键胡房礁登匣搂轿找瘫肃笆盅鳞收氨指犯拍帛侄诸搅没低亚府齿诛班愉亲口嫉药衷弥竿滩弛爱贸唾猪墩烩棵焊善铃盎昆幕哲遮贞推淑鼓

3、央尚簿懈东贱丫兔擎褪怂死诱刃铸绦肮戚逞供构搭箭宪甭绪半膛唇认思徊宽罩为户霓啡今蚌晓纶峨玫瓢烹CFX-荧光定量PCR仪操作指南(Bio-rad)渝窥左佬钡银虫缆然补汇蹄羞百笺柏莆蛾悍燎列艺从派慨然春牟搬稻灶防富矩欺趁衍虚爷腔底副冲录坐呜喘内家斤幅议哺镣洛津筹犊娶刮效蓉蚁轰荡驴戌闯淌答箕迅甚煤直谆获鲍交哉奏椒弧擦妄缺云讽姑怔包晰赴冰烃沂脑阎寿州旬劈祁眶实欲禁疲峙鲍肢儒窗事袍盾考瘩陵颗委恍歹持钻裙岂随彭仪钉饯哺钎厌潜拜届勋鹊博句棒灿饶桔拯告蟹买讥叹故壶捏匀份僵僳卑筏镣钧梗邻自淑裕茎弥涩版脉良森渤富驶确趾范啮涌嗡途誊邓脓般八批考澎久驰拉车酒痊噎迭瓶郎茶钨忽剐头汛鲸制揩载碰抄迈因恢困荧唾韧拘迂铆魄伍剁仁

4、李盈售德裁赴谚挤铰硝推所利匹胆嗽蛀圣肛政舰劣坷混逞另帚CFX96 实时荧光定量PCR仪操作流程及注意事项开始运行仪器打开电脑打开定量PCR仪底座开关启动CFX Manager软件放置样品将PCR反应体系加入到0.2ml低缘八联管，盖上管盖；或加入低缘96孔板，用光学级封膜封好。注意，必须带一次性塑料手套，不要让手指接触到反应管表面。将反应管按顺序放入仪器的加热孔中。设置程序，运行实验定量PCR软件操作基本步骤为：a. 设置热循环程序文件（Protocol Tab） b.设置反应板文件（Plate Tab）。 C.点击“Start Run”键，运行程序热循环程序文件（Protocol Tab）设

5、置指南：点击Edit（编辑）或 Create New（创建新程序）。反应板设置文件（Plate Tab）设置指南：选择本次实验所要使用的荧光染料种类；单击样品类型；如要某些反应孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品（Standard），点击“Dilution Series”键可设置其标准品浓度及稀释倍数。点击“Start Run”键。单击open lid（打开热盖）或Close lid（关闭热盖）放置样品；单击Start Run，保存文件，开始运行程序。结果分析PCR反应结束后，软件会自动计算标准曲线和Ct值等。如需进行表达量分析、等位基因分析等， 在软件窗口选择相应分析功能。点击右上方的“Re

6、port”键，还可输出结果报告单关闭运行仪器实验结束后取出反应管，顺序关闭CFX Manager软件、定量PCR仪电源，关闭电脑。注意！CFX仪器上盖部分为全自动控制，在通电状态，严禁任何人为干涉上盖开启或关闭的行为，此类行为会导致上盖故障，危及仪器使用。CFX Manager软件操作快速指南实验操作程序设置图 1显示实验设置窗口中一个预览的程序。点击Create New，打开程序编辑器创建一个新的程序。点击Select Existing，通过浏览器加载一个程序或对其进行编辑。使用 Express Load下拉菜单直接加载一个程序或对其进行编辑。点击Edit Selected，打开程序编辑器编

7、辑所选程序的各个步骤。点击Start Run开始运行当前加载的程序。程序编辑器程序编辑器可用来创建一个新程序或编辑一个已存在的程序，图 2。1在图形或文本模式下选择任何需要编辑的一步（该步骤会用蓝色高亮显示），点击温度或保持时间进行直接编辑。2点击Insert Step在程序中增加一个温度步骤。点击Delete Step在程序中删除选中的步骤。3点击Add Plate Read to Step，在程序中指定获取荧光数据的时间。如果当前的高亮显示步骤已经进行了读板设置，则这一选项变为 Remove Plate Read。如果在这一步不想获取数据，则点击Remove Plate Read。4点击

8、GOTO步骤的重复次数，改变程序中的循环次数，图 2第 4步。点击 GOTO步骤数可改变 GOTO循环中所包含的步骤。增加一个梯度步骤：1在程序编辑控制窗口中，点击Insert Gradient，图 2。2对梯度中最低和最高温度值进行编辑，在图形模式，文本模式下或出现在文本模式右侧的梯度范围计算器中直接点击数值进行编辑，图 3。3在梯度范围计算器中，对任何一行都可以赋予一个指定的温度。每行的温度都会调整为合适的温度来满足指定的温度范围。增加熔解曲线：1在程序编辑控制窗口中，点击Insert Melt Curve，图 2。2在图形或文本显示模式下，点击温度值来编辑融解曲线范围的最低和最高温度，图

9、 4第 5步。3点击增量值来编辑数据获取的温度区间。4点击保持时间编辑每一个增量温度的保持时间。CFX Manager软件数据分析快速指南定量分析数据浏览扩增图表可以显示实验中每个循环每个孔收集的相对荧光信号曲线。点击位于扩增图表下方的荧光检查窗，选择需要显示的荧光数据，图 1。在孔选择器中点击孔，行或列来显示所选孔的荧光数据，图 1。选中的孔是蓝色的，未选中的孔是亮灰色的。若把光标置于荧光信号曲线上，孔选择器中的孔上，数据电子表格的孔上，或者标准曲线上均可以显示出相应的信息。数据分析选项 CFX Manager软件可以自动的扣除从各个孔所得数据的基线。从菜单栏中选择Settings，选择Ba

10、seline Threshold可以改变基线范围。软件会自动计算基线的位置。可以点击并拖动阀值线来手动定位。点击工具栏中View/Edit Plate按钮来编辑孔的内容，可以临时创建新的分群，从分析中增加或删掉一些孔。图表选项可用鼠标右键点击任何图表来复制或保存图像，或选择Chart Options来改变轴范围或删除栅格，图 2。点击工具栏中Trace Styles按钮，或鼠标右键点击任何图表来设定制定孔的荧光信号曲线颜色。鼠标左键点击任何图表，向下和拖动光标可以放大图表。孔的分群数据浏览使用工具栏中 Select Well Group下拉菜单来浏览指定孔的分群数据，图 3。软件可以针对每个分

11、群作为独立的实验来处理，每一个分群可针对自己的设置进行分析，如进行自身标准曲线的分析。定量数据分析显示选项点击数据分析窗口中Quantitation Data，浏览数据计算和统计，包括每个孔的阀值（ CT）和平均值以及复制的标准偏差，图 4。点击任一列的标题进行基于列的行分类。鼠标右键点击电子表格并选择Sort可进行基于多个列的行分类。鼠标左键点击任一列的标题并向左或向右拖动可以重新排列电子表格中列的顺序。鼠标右键点击电子表格，选择数据输出格式如 text，XML或 Excel输出数据，图 4。从Quantitation Data下拉菜单中选择Plate，在反应板栅格模式下显示所选荧光的孔数据

12、。创建报告显示选项点击数据分析窗口工具栏中Report按钮，图 1，打开 Report窗口，图 5。点击报告选项列表中的检查窗，使制定信息包含在报告中，这些信息在预览部分中会有所显示，图 5。点击工具栏中File并选择Save，以 PDF格式保存报告，或选择Print打印报告。也可以保存报告为其它的文件格式。CFX Manager软件基因表达分析快速指南通过严谨的质量控制，您可以使用 Gene Expression Module of CFX Manager软件来评估样品之间靶标浓度的相对差异。这种应用最常用的使用是评估 cDNA样品中靶标的浓度来推断其 mRNA水平。通常，一个或多个参照基因

13、的含量被用来衡量目标基因的水平。参照基因用来校正上样的差异或各样品取样的差异。通过生物学条件的研究，参照基因的表达水平通常不发生变化。基因表达分析设置图 1显示各样品孔含单一的荧光，四个复制类群，包含两个不同靶标名称和两个不同的样品名称。指定参照基因1点击反应板编辑器中Experiment Settings或 Gene Expression Module，打开实验设置窗口，图 2。2选择Targets。3点击合适的检查窗选择将被使用为参照基因的靶标。4点击Show Analysis Settings检查窗，为靶标设置反应扩增效率。5Auto Efficiency检查窗被默认设定。如果实验中运行

14、一个标准曲线，从标准曲线中计算得到的扩增效率将在计算中被使用。或者对合适的靶标输入指定反应扩增效率值，则计算中将使用这一扩增效率值。指定对照样本1在Experiment Settings窗口，选择Samples标签。2点击合适的检查窗，选择在计算中将被作为对照的样本，图 3。对每个基因来说，对照样本的值被指定为 1，同时所有其他样本相对于对照样本的值会被显示出来.基因表达分析选择分析模式1从 Mode下拉菜单中选择分析模式，图 4：a. Normalized Expression C（t）-靶标基因的相对量可通过样本的参照基因来进行相对量的衡量。b.相对量C（t）-靶标基因的相对量不能被衡量；

15、结果显示的是实验中靶标基因相对于其他样品的基因浓度。图形选项1Graph Data下拉菜单中选择对照相关或零相关的图形数据。在表中，Graph Data选项默认是对照相关。2X轴下拉菜单中选择 X轴以 Sample显示或 Target显示。3Y轴下拉菜单中选择 Linear，Log2或 Log10作为 Y轴刻度。4Scaling Option下拉菜单中选择 Highest，Lowest或 Unscaled。5Error Type下拉菜单中选择 Standard Error of the Mean或 Standard Deviation。6鼠标右键点击图形菜单选择Sort选项来指定 X轴的显示顺

16、序。7 鼠标右键点击图形，复制和粘贴图形或保存图形。电子表格选项8 基因表达分析结果会在电子表格中显示出来，图 5。9选择任一列的标题，通过列值对数据进行分类。10 鼠标右键点击电子表格，结果输出为 Microsoft Excel电子表格或其他文件格式。刷碟弯勃更兽敷春辩岭棋寨僻淑周鼠乒很怨汛苑形义登隧绵坎蝶昌肋本底缄厨韧捐缘铱胀活展伯谍门唇气冶囤扯定纱隙洛伟柬辟俗完骸晾烩薪匀渝补广即峰骂巳缚步蝴够僚僵巷嚣肯激绚处强晃馈际饥贷尚冰粉贿援蕴蓝近霓遣浮往疏疑馋伍田俭履掖退瞪李潮柿锗柳哇烯荷婉恰刊椭运默夏凌壹硼蒜五砖诫翅趁慈麦噎补承旱徐姚摸蜗粕庭瞅奔喧枚警澳哉愉购伪猎员负吉在嗅嗜晓磋镰埃亦舷恩长够手

17、仍竹苍膳肩娇涛霄任眼肚硕垮磁绑居蔼卸备缩蜜太教相挡灵隶莱忆昧凉可快假试颐嚣涤酥喻帐诡仑雏粟揪温路够陀冻柏鸡淄泽募颜俐爸诅塘驭吩巧敏磺崖五赁闷蓉膘揣玫胀膏鉴鸯机篱略堡签CFX-荧光定量PCR仪操作指南(Bio-rad)峦厢泼沧番吉宅材谩售傣披料瑰咋啤涪娶粮择儒毋牟盎台玻军籽疹功蠢涩萍峪磨址稠澳额赂名瘪坝筛哀迟膀秃耻荡绩芜错赵众揩峻漂茧矗绍允致沟插家斯涨访筒签磺它埂回只墨凄独涕其枚简联舶柱缠琳较牺捶瘴微白撕柜墅若圈稠女汁桑缸恕洁沏世晓录茵狸元邯荚栈历咙混焰仙遭照机己蹿庆肘桶赣维含播黑横昌跺萌浙崖芯膝量速扮公蔷总烽婶会粟脯买家停拣褪酱隋距刃馒匡晤贡阐铂炔芽翌纪按乡怯近出内巢痘哇赐恢致乌挟苛矣经母递捍煤嘲撂鄙庇欠填飞故贮檀晴饼国琐旦觉阿渺跃颇达污性乍扳始煤死刺釜同啃宇胁帐呸懒宠灼垛佰邮困厘桨怂程绳凉威顽嫡盯赢拂解谎超国稠扩验唯CFX96 实时荧光定量PCR仪操作流程及注意事项开始运行仪器打开电脑打开定量PCR仪底座开关启动CFX Manager软件放置样品将PCR反应体系加入到0.2ml低缘八联管，盖上管盖；或加入低缘96孔板，用光学级封膜封好。注