201107临床高唐鑫子科研立项申报书.doc - 牡丹江医学院

1、编号： 200107 牡 丹 江 医 学 院学生科研项目立项申报书学 科 分 类： 项目名称：甲珠对肝星型细胞活化影响的机制研究完成细胞实验，整理、分析实验结果申请人： 高唐鑫子 所 在 学 院： 牡丹江医学院临床医学院指导教师： 付德才填表日期： 2010年12月7日类 别：科学发明创造r学术研究科研调查是否推荐重点项目（由二级学院填写）：r是 否是否重点项目（由科研处填写）：是 否申请人姓名高唐鑫子性别女民族汉出生日期1989年4月所 在 学 院牡丹江医学院专业临床医学年 级 07级项目名称甲珠对肝星型细胞活化影响的机制研究电子邮箱454683230qq.com移动电话1594532261

2、8项目类别科学发明创造 r学术研究 科研调查 一般项目 重点项目研究起始时间2010年7月 完成时间2011年 3 月 申请人参加科研的经历何年何月至何年何月参加的项目担任的工作2008年5月2008年9月胃癌与mp9蛋白表达的相关性研究免疫组织化学申请承诺我承诺对本人填写的各项内容的真实性负责，保证没有知识产权争议。如获准立项，我承诺以本表为有约束力的协议，遵守牡丹江医学院大学生科研立项管理办法的有关规定，按计划认真开展研究工作，取得预期研究成果，按时结项。申请人签字：年月日项目组其他成员（不包括申请人和指导教师）年级所在院系专业姓名性别专 业年 级联系方式分工签名 吴林林女临床医学 07级

3完成细胞实验，整理、分析实验结果研究项目简介1、选题意义：国内外研究现状、意义。我国是肝炎的大国，其中乙肝感染者约1.2亿， 25%最终将死于重症慢性肝病、肝硬化及肝癌。慢性乙肝病毒无症状携带者中肝组织正常者仅占10%左右，轻微病变占11.5%-48.2%，其他近50%以上病例表现为慢性肝炎甚至肝硬化病理改变。目前治疗乙肝、丙肝、丁肝病毒的临床疗效还不很理想，对慢性乙肝病毒无症状病毒携带者不主张抗病毒治疗，其中轻微病变者随着时间的推移，日积月累由量变到质变，部分患者可直接演变为肝硬化、肝癌，成为重危病症。因此，对肝硬化的及早防治，是十分必要的。肝纤维化作为肝硬化的前期阶

4、段，其可逆性为临床防治肝硬化提供了良好契机，防治和逆转肝纤维化是延缓或阻止肝硬化发生的重要手段，为肝病患者延长寿命、提高生命质量提供了可能。肝纤维化的防治和逆转已成为该领域国内外同行的研究热点。目前的研究认为，肝纤维化的病理改变是细胞外基质(ecm)的增生和降解失衡所致，而病理情况下细胞外基质的主要细胞来源是肝星状细胞(hsc)，他的激活和增生在肝纤维化过程中起主要作用。肝星状细胞又称1to细胞，是肝间质细胞之一。正常肝脏的hsc占肝细胞数量的5% 10%,定居在窦间隙1。各种原因导致的肝实质细胞的损伤为hsc激活的始动因素,再经一系列细胞因子的调控而活化。肝星状细胞在肝纤维化过程中，可以转变

5、为纤维样细胞或肌纤维细胞( myof i brtrobj a s t , mfb)，这一过程称为活化，hscs表型发生改变,从富含维生素a的静态细胞表型转化为肌成纤维细胞表型,即活化的hscs，通过旁分泌与自分泌作用，使hsc增殖，合成大量的细胞外基质（ecm），以致其在肝内大量沉积，肝纤维化逐渐形成2、3。肝星状细胞的活化是各种肝脏疾病纤维化的共同途径，即表明，hsc活化是各种病因肝纤维化发生的共同中心环节4。目前认为hsc激活形成的肌成纤维样细胞是肝纤维化ecm的主要来源细胞。实验发现，四氯化碳诱导的实验性肝纤维化大鼠肝组织星状细胞数量显著多于正常对照大鼠，并且纤维化模型肝星状细胞合成胶原

6、是正常大鼠的2.7倍。激活的肝星状细胞的特点之一是表达-肌动蛋白(-sma)，-sma是hsc活化的标志，常作为肝星状细胞激活的标记物。转化生长因子1（tgf1）是目前已知的最强的致纤维化因子, 可促进hsc表达型胶原, 并促进hsc向肌成纤维样细胞转化5。血小板衍生生长因子（pdgf）是最强的有丝分裂原, 对hsc增殖具有明显的促进作用3。目前认为,防治hf 的策略主要包括: 去除病因; 保护肝细胞; 抑制肝炎症反应; 拮抗促纤维化细胞因子的作用; 抑制hsc 激活和增殖,促进其凋亡; 抑制细胞外基质的合成,促进其降解; 基因调控。由于肝纤维化形成机制极其复杂, 具有病因多样性、进展渐变性、

7、病变可逆性、最终难治性等特点, 而西药治疗往往只针对某一方面或某一环节, 难以取得满意的效果. 近年来国内学者在中药抗肝纤维化方面取得了可喜的成效, 使中药在这一领域的研究与应用倍受青睐和重视. 中医认为慢性肝炎、肝硬化的临床征候错综复杂,但其基本病机是正衰邪盛, 湿热未尽兼血瘀, 肝郁脾肾气血虚. 血瘀表现在慢性肝炎、肝硬化的病理上就是肝纤维化形成. 由此中医确立了“活血化瘀”、“通络养肝”的治疗理论. 目前西医尚缺乏非常有效的抗肝纤维化治疗手段, 而许多中药诸如丹参、桃仁、虫草菌丝、汉防己等, 在临床和实验研究中已被证实具有较好的抗肝纤维化作用6. 中医中药在治疗肝纤维化方面体现出巨大的优

8、势, 近几年中医药治疗肝纤维化的实验和临床研究的成果展示了广阔的应用前景, 国内在中医药抗肝纤维化方面的实验研究十分活跃. 甲珠为穿山甲的鳞片，主归肝经，具有软坚、通络、散结的功效，是历代医家治疗癥、瘕、集、聚的常用药，近来，被广泛用治肝硬化取得了较好的临床效果。甲珠为哺乳纲鲮鲤科动物穿山甲（pangolin scales）的鳞甲，味咸，微寒，入肝、胃经，主要的化学成分有多种氨基酸、锌、钾等微量元素及l-丝-l-酪环二肽、d-丝- l-酪环二肽。其性善走窜，能祛瘀散结、攻坚排脓、搜风通络。药理研究降低血液粘度，抗炎临床常用治乳腺疾病（治疗乳腺增生，急性化脓性乳腺炎，产后缺乳）；对血红蛋白、血小

9、板及淋巴细胞转化率等均有升高作用；血栓性静脉炎。目前，关于甲珠的药理研究甚少，具体药理机制尚不清楚。近年采取人工养殖穿山甲的办法，使穿山甲数量明显增多，为甲珠提供了丰富的药物来源，因此具有很好的推广、应用前景。2、研究内容：本项目研究的基本思路和主要观点。具体内容：本项目分动物体内实验和细胞实验两部分。动物体内实验采用wistar 大鼠做动物模型，分组造模，于造模后分别检测各组血清肝功、纤维化四项；he染色，masson三色染色(染胶原纤维)及网织纤维染色，光镜下观察肝组织病理改变；免疫组织化学检测肝组织-sma、tgf1、pdgf蛋白表达；rt-pcr半定量检测sma、tgf1、-smamr

10、na在肝组织表达。电镜下观察肝组织内星型细胞形态及数量变化，并进行各组间比较。判断甲珠治疗组对肝组织内星型细胞活化及相关细胞因子表达的影响，探讨甲珠抗肝纤维化的作用机制。细胞实验采用大鼠hsc-t6细胞株，复苏后培养，72 h传代。实验用处于对数生长期的hsc。分成正常对照组和实验组，实验组根据药物浓度又分成高剂量组，中剂量组，低剂量组。使细胞同步化于g0期，开始培养，实验高剂量组每升含药2.0克；实验中剂量组每升含药1.5克；实验低剂量组每升含药1.0克，继续培养24小时，取上清液检测-sma，电子透镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞数量，进行各组间比对，判断甲珠对星型细胞的影响。拟重点解决

11、的科学问题：证实甲珠可以抑制tgf1、pdgf、-sma的表达；证实甲珠可以使实验鼠血清肝纤维化四项降低；证实甲珠可以使实验鼠肝组织病理改变好转；证实甲珠可以抑制实验鼠肝组织内hsc活化；证实甲珠可以使hsc-t6表达-sma减少；证实甲珠可以使活化hsc增殖指数明显降低，从而抑制星型细胞活化。甲珠具有良好的抗肝纤维化作用，应用甲珠可以预防肝纤维化及肝硬化的发生。3、研究方式和进度安排：拟采用的研究方法、技术路线及进度初步安排。研究方法：分动物体内实验和细胞实验两部分。动物体内实验已完成。细胞实验采用大鼠hsc-t6细胞株，复苏后培养，72 h传代。实验用处于对数生长期的hsc。分成对照组和实

12、验组，实验组根据药物浓度又分成高剂量组，中剂量组，低剂量组。使细胞同步化于g0期，开始培养，实验高剂量组每升含药2.0克；实验中剂量组每升含药1.0克；实验低剂量组每升含药0.5克，继续培养24小时，取上清液检测-sma，电子透镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞数量，进行各组间比对。技术路线： 细胞实验大鼠hsc-t6细胞株，复苏后培养，72 h传代，分组对照组高剂量组中剂量组低剂量组秋水仙碱组予甲珠2g/l培养24小时予甲珠1g/l培养24小时予甲珠0.5g/l培养24小时予秋水仙碱0.1mg/l培养24小时取上清液检测-sma电子透镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞数量实验方案:采用动物实

13、验与细胞实验两部分。动物实验已完成。细胞实验两部分在细胞培养的同时，加用甲珠干预，检测干预后上清液中星型细胞活化标志物-sma，电子透镜观察星型细胞形态，流式细胞仪检测星型细胞数量，从而判断甲珠对星型细胞活化的影响。4、预期价值和成果形式：研究的理论创新程度或实际应用价值，结项提交的成果形式。该课题研究了中药甲珠对肝纤维化模型鼠体内最强的致纤维化因子转化生长因子1（tgf1）及其下游信号传导因子smad3表达的影响，研究了甲珠对实验鼠血清肝纤维化四项的影响，研究了甲珠对肝纤维化大鼠肝组织氧化指标hyp、mda、sod的影响。结果甲珠可降低实验鼠血清肝纤维化四项，降低实验鼠肝症状tgf1、sma

14、d3的表达，可降低肝纤维化大鼠肝组织氧化指标hyp、mda的表达，使sod活性明显提高。本项目旨在更进一步深入研究甲珠对肝纤维化的影响机制。5、研究项目有何创新、有何特点。1、可行性强：我院拥有黑龙江省肝纤维化重点实验室一个，中心实验室、各教研室实验室多个。拥有流式细胞仪、高倍透射电子显微镜，二氧化碳培养箱(mco175)为日本sanyo 公司产品, ph 酸度计为德国inolab 公司产品; 550 型酶标仪 (美国bio-rad 公司，凝胶电泳仪，pcr仪，多功能全自动生化仪等大型设备。所涉及的实验内容在我院基本能完成。四氯化碳造模技术成熟，实验中所涉及的试剂及药物容易购得，实验手段成熟，

15、未涉及高难实验手段。整个实验可行，容易完成。2、中西医结合：中医药在肝纤维化相关因子的研究中取得了较多的成果，对各种相关因子的作用也有较深入的阐述。在传统医学理论的指导下，借助现代医学的研究成果和方法，针对研究中出现的问题，对中医药抗肝纤维化进行系统、详细的分析将会对医学的进步与发展产生重要的意义。3、研究前景广阔：虽然许多研究证实中医药对于抗肝纤维化具有较好的作用，但它们的药理机制尚未完全清楚，因此针对不同药物在抗肝纤维化中所起作用的不同，可进一步研究其各自具体的药理作用，以更明确、详细的了解药物本身作用机理，最终得以很好的应用于临床；另外，还可在动物造模上拓宽思路，综合考虑。通过对病毒性肝

16、炎、酒精性肝炎以及脂肪肝等所致肝纤维化病因、病理的研究，针对主要病因，建立能真实、客观反映人类肝纤维化的发病机理的动物模型。在以后的研究中，一方面可以寻找新的有效成分，另一方面可开展已有的几种有效成分之间的作用比较，去粗取精，进一步阐明不同成分的主要作用机制，以寻找疗效更佳的药物。6、主要参考文献。1 wake k.perisinusoidal stellate cells（fat-storing cells interstitial cells lipocytes）,their related structure in and around the liver sinusoids,and v

17、itamin a-storing cells in extrahepatic organs.int rev cytol，1980，66:303-353.2 parsons cj,bradford bu,pan cq,et al.antifibrotic effects of a tissue inhibitor of metalloproteinase-1 antibody on established liver fibrosis in rats.hepatology,2004,40（5）:1106-l1153 sato m,suzuki s,senoo h.hepatic stellate

18、 cells:unique characteristics in cell biology an d phenotype.ceil struct funct,2003,28（2）:105-l124 cassiman d，libbrecht l，desmet v，etal.hepatic stellate cell/ myofibroblast subpopulations in fibrotic human and rat liversj.j hepatol,2002,36：2002,209.5 akiyoshi s，ishii m，nemoto n，kawabata m，aburatani h，miyazono kj.jpn j cancer res,2001，92：257-268.6 李泓俊,彭欣辉,吴应莲,等.虫草多糖脂质体对小鼠免疫性肝纤维化-smamrna表达的影响j.医学临床研究，2004，21（5）：500-503.指导教师姓名付德才性别男政治面貌党员职称副主任，教授所在单位牡丹江医学院电子信箱电话136146061971、对申请人的专业基础、学风及研究能力的评价： 该学生学习刻苦认真，实践能力强；曾参与并协助老师完成了组织免疫化学方面的科学研究，有较好的理论基础和实践经验，能凭借自身良好