全脑缺血大鼠海马GLT-1和GFAP的表达

1、全脑缺血大鼠海马GLT-1和GFAP 的表达 本课题得到国家自然科学基金资助（No: 30770738）、教育部博士点专项基金资助（No: 20050089001）、河北省自然科学基金资助（No: C2008001042）。张敏1，李文斌1,2，李清君1，李淑琴1，羡晓辉1，孙晓彩11河北医科大学病理生理学教研室，石家庄 (050017)2河北省脑老化与认知重点实验室，石家庄 (050031) E-mail：摘 要： 本文应用免疫组织化学法研究了大鼠全脑缺血后，海马CA1、CA3区中GLT-1及GFAP 的表达。1

2、5只雄性Wistar大鼠，随机分为3组：control组；假手术组；损伤性缺血组。假手术组、损伤性缺血组大鼠分别在假手术后或缺血再灌后常温饲养7天。损伤性缺血组，海马CA1区锥体神经元几乎全部死亡；死亡的锥体细胞周围GLT-1的表达减少，甚至表现为GLT-1大片缺失；同时可见该区星型胶质细胞的胞体肥大，突起增粗、但明显断裂、残缺。损伤性缺血组海马CA3区的神经元未见到明显的损伤；GLT-1的表现明显上调，尤其以锥体细胞周围上调的最为明显，在锥体细胞周围形成非常明显的网格状结构；该区星型胶质细胞的胞体并不明显增大，但突起明显环绕神经元胞体，形成非常明显的网格状。提示，海马CA3区锥体神经元周围大

3、量表达的GLT-1有利于保护锥体神经元免于缺血性损伤。关键词：脑缺血；GLT-1；GFAP；免疫组织化学；大鼠1.前言短暂的全脑缺血打击，可以引起海马CA1区谷氨酸等兴奋性氨基酸浓度异常升高，从而发挥神经毒作用，导致锥体神经元发生迟发性死亡，而CA3区锥体神经元却可以免受此损伤13。都是海马的构成部分之一，如此紧密相邻的2个亚区，对缺血性打击出现了不完全相同的反应，此现象值得研究。大量研究提示星型胶质细胞所表达的谷氨酸转运体GLT-1在脑缺血时对谷氨酸的摄取减少、甚至将细胞内的谷氨酸释放到细胞外，引起细胞外谷氨酸浓度异常升高，发挥神经毒作用4, 5。据此我们推测，在脑缺血时，海马CA1、CA3

4、区的GLT-1、GFAP 的表达可能存在一定的差异。本实验旨在观察脑缺血时海马CA1、CA3区GLT-1及GFAP 的表达。2. 方法2.1 实验分组雄性Wistar大鼠15只，随机分为3组：control组（n=5）；假手术（Sham）组（n=5）；只暴露双侧颈总动脉，不阻断血流；损伤性缺血组（n=5）：夹闭双侧颈总动脉8 min作为损伤性缺血。2.2 全脑缺血动物模型的制备采用四血管闭塞法（Four-vessel occlusion，4-VO）制造大鼠全脑缺血模型6。除对照组之外，所有动物均首先电灼凝闭双侧椎动脉，方法如下：10%水合氯醛350 mg/kg腹腔麻醉下，颈部背侧纵切口约1.5

5、 cm，分离颈旁肌暴露第一颈椎横突，寻找翼状孔，将预热的电灼针插入翼状孔中，热凝闭双侧椎动脉，使其永久性闭塞；庆大霉素盐水冲洗、缝合创口。术后恢复48 h，选用恢复良好的动物制作全脑缺血模型。在乙醚麻醉下，游离双侧颈总动脉，待动物清醒后，Sham组仅暴露双侧颈总动脉，但并不夹闭颈总动脉；损伤性缺血组，夹闭双侧颈总动脉8 min作为损伤性缺血打击，然后恢复血流再灌注。庆大霉素冲洗、缝合创口。实验过程中，室温保持20以上，用白炽灯照射动物以维持其肛温在37左右，直到恢复活动。夹闭双侧颈总动脉期间，可观察到大鼠瞳孔散大，脑电波频率变慢，波幅逐渐缩小甚至呈等电位线，翻正反射消失，证明产生脑缺血。Sha

6、m组、损伤性缺血组大鼠分别在暴露双侧颈总动脉术后或夹闭双侧颈总动脉缺血再灌后，常温饲养7 d，灌注取材，制成5m后的石蜡切片。部分切片用于硫堇染色，在光学显微镜下观察大鼠海马CA1区、CA3区的组织形态；部分切片用于免疫组织化学染色，观察GFAP、GLT-1蛋白的表达。2.3 GLT-1、GFAP免疫组织化学染色二甲苯、梯度酒精脱蜡至水，3%H2O2孵育15 min消除内源性过氧化物酶；微波修复抗原，9298，18 min；10%正常山羊血清封闭，37，1 h。而后部分切片进行GLT-1的免疫组化染色：一抗为豚鼠来源的 anti-GLT-1多克隆抗体 (1:3000, Chemicon)，4孵

7、育，18h；二抗为生物素标记的山羊抗豚鼠 IgG （1:1000，Chemicon），37孵育，1h；三抗为辣根过氧化物酶标记的抗山羊IgG（Santa Cruz），37孵育，50min；DAB发色。部分切片进行GFAP的免疫组化染色：一抗为山羊来源的 anti-GFAP 多克隆抗体（1:80，Sigma），4孵育，18h；二抗为生物素标记的羊抗兔 IgG （Santa Cruz），37孵育，1h；三抗为辣根过氧化物酶标记的抗山羊IgG （Santa Cruz），37孵育，50min；DAB发色。阴性对照以0.01M PBS代替一抗。用Motic显微镜对大鼠海马进行病理学评价，定性观察大鼠海马

8、GLT-1、GFAP阳性标记物的形态及分布特征。3.结果3.1硫堇染色Control组海马CA1区锥体细胞排列整齐致密，可见23层，细胞形态完整、边界清晰、尼氏小体丰富，胞核大而圆、染色较浅，核浆比大，核仁深染、清晰（图1A、1B）。海马CA3区，control组的神经元排列较为稀疏，胞体普遍略大于CA1区的锥体细胞，胞核大而圆、染色较浅，核浆比小于CA1区的锥体细胞，核仁深染、清晰（图1C）。Sham组，海马CA1区均未见明显损伤，与control组相比无明显差异。海马CA3区的神经元与control组该区的相比，亦未见到明显的损伤。损伤性缺血组，海马CA1区锥体细胞表现为几乎全部神经元死亡

9、（图1D）。海马CA3区的神经元未见到明显的损伤（图1E）。CDEAB图1 大鼠海马的神经病理学评价（硫堇染色）。A：control组海马低倍；B：control组海马CA1区；C：control组海马CA3区；D：缺血组海马CA1区；E：缺血组海马CA3区；图1A标尺为200m；图1BE标尺为50m。3.2 GLT-1 免疫组化染色BCADEF图2 大鼠海马CA1区、CA3区GLT-1的表达（标尺为50m）。A：control组海马CA1区；B：Sham组海马CA1区；C：缺血组海马CA1区；D：control组海马CA3区；E：Sham组海马CA3区；F：缺血组海马CA3区。CA1区，对照

10、组可见在海马有一定量GLT-1阳性标记物（图2A）。与对照组相比，Sham组可以见到GLT-1的表达增多（图2B）。与Sham相比，损伤性缺血组在死亡的锥体细胞周围GLT-1的表达减少，甚至表现为GLT-1大片缺失（图2C）。CA3区，对照组可见在海马有一定量GLT-1阳性标记物（图2D）。Sham组未见到GLT-1明显变化（图2E）。与Sham组相比较，损伤性缺血组GLT-1的表现明显上调，尤其以锥体细胞周围上调的最为明显，在锥体细胞周围形成非常明显的网格状结构（图2F）。3.3 GFAP 免疫组化染色CA1区，control组GFAP免疫组化染色显示形态完整的星形胶质细胞呈星形或蜘蛛状，胶

11、质细胞散在均匀分布，有明显的突起，突起不环绕神经元胞体（图3A）。Sham组与control组相比，星形胶质细胞的数量有所减少，突起亦不环绕神经元胞体（图3B）。损伤性缺血组星形胶质细胞的数目明显增多，胞体肥大，突起增粗、但明显断裂、残缺（图3C）。CA3区，control组GFAP免疫组化染色显示胶质细胞散在均匀分布，突起亦不环绕神经元胞体（图3D）。Sham组与control组相比，星形胶质细胞的突起环绕神经元胞体，形成隐隐约约的网格状（图3E）。损伤性缺血组CA3区星形胶质细胞的胞体并不明显增大，但突起环绕神经元胞体，形成非常明显的网格状（图3F）。FBCDEA图3 大鼠海马CA1区、C

12、A3区GFAP的表达（标尺为50m）。A：control组海马CA1区；B：Sham组海马CA1区；C：缺血组海马CA1区；D：control组海马CA3区；E：Sham组海马CA3区；F：缺血组海马CA3区。4.讨论本实验通过硫堇染色进行的神经病理学评价显示，8 min的全脑缺血引起大鼠海马CA1区锥体神经元明显死亡，而海马CA3区锥体神经元却未见明显受损。表明CA3区锥体神经元对缺血具有更强的耐受性。这一现象已被多项研究所证实13 。大量研究证实，脑缺血时细胞外液谷氨酸等兴奋性氨基酸的浓度异常升高。这些兴奋性氨基酸与其受体结合，引起这些受体异常过度兴奋，产生神经毒效应，导致神经元损伤。因此

13、，这些异常增多的兴奋性氨基酸被称为兴奋性神经毒素7。由于胞外没有谷氨酸代谢酶，中枢神经系统细胞外液中谷氨酸的稳态主要由兴奋性氨基酸转运体（excitatory amino acid transports, EAATs）来调节。到目前为止，发现并克隆了五种高亲和性EAATs，分别为EAAT1（GLAST）、EAAT2（GLT-1）、EAAT3（EAAC1）、EAAT4和EAAT5 8。生理情况下，这些EAATs转运细胞外的谷氨酸进入细胞内，降低其在突触间隙的浓度，在及时终止突触传递以及防止谷氨酸受体过度兴奋中发挥重要作用。一般认为，GLT-1为胶质细胞转运体，主要分布在星形胶质细胞，含量非常丰富

14、，在脑和脊髓的星形胶质细胞均有分布，部分海马神经元的兴奋性神经末梢也有分布9。与其它几种EAATs相比，应用基因敲除技术与反义寡聚核苷酸技术所得到的实验结果均证实，GLT-1在终止谷氨酸能神经传递，维持细胞外液谷氨酸浓度处于低水平方面发挥更为重要的作用10。GLT-1的免疫组织化学染色发现，对照组大鼠海马CA1区GLT-1的表达较少，染色较浅；而CA3区GLT-1的表达较多，染色较深。8 min的全脑缺血引起死亡的锥体细胞周围GLT-1的表达减少，甚至表现为GLT-1大片缺失。而CA3区GLT-1的表现明显上调，尤其以锥体细胞周围上调的最为明显，在锥体细胞周围形成非常明显的网格状结构。上述现象

15、表明，锥体神经元周围GLT-1的存在与否对于神经元的存活是非常重要的。 GFAP免疫组化染色显示，对照组大鼠在海马CA1区和CA3区均存在大量星型胶质细胞。8 min的全脑缺血引起海马CA1区星型胶质细胞胞体肥大、突起增粗或残缺不全。结合病理学评价，锥体神经元明显死亡时伴随着星型胶质细胞胞体肥大、突起残缺不全，提示这种肥大的星型胶质细胞未能保护锥体神经元免于缺血性损伤。损伤性缺血组CA3区星形胶质细胞的胞体并不明显增大，但突起明显延长并环绕神经元胞体，形成非常明显的网格状，提示星形胶质细胞与锥体神经元的这种密切关系，有利于保护锥体神经元免于缺血性损伤。参考文献1 Deierborg Olsso

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22、 GLT-1 and GFAP in the hippocampus of rats after global brain ischemia ZHANG Min, LI Wenbin, LI Qingjun, LI Shuqin, XIAN Xiaohui, SUN XiaocaiDepartment of Pathophysiology, Hebei Medical University, Shijiazhuang, 050017AbstractThe expression of GLT-1 and GFAP in the hippocampal CA1 and CA3 subfield a

23、fter global brain ischemia was studied by immunohistochemistry in the experiment. Fifteen adult male Wistar rats were randomly divided into 3 groups: control group; sham group and global brain ischemia group. Rats in sham group and global brain ischemia group were raised for 7 days after the sham op

24、eration or reperfusion. In the hippocampal CA1 subfield after global brain ischemia insult, almost all pyramidal neurons died. The GLT-1 expression was markedly decreased in the area where almost complete pyramidal neurons died, and the neighboring area of the pyramidal layer even appeared as a sheet absence of GLT-1 immunoreactivity. At the same time, astrocytes hypertrophied in soma with thickened processes that began to col