非禽源细胞及其制品外源病毒检验SOP之猪瘟活疫苗检测

1、非禽源制品外源病毒检验sop之猪瘟活疫苗检测一、目的 用于规范猪瘟活疫苗的外源病毒检验。二、适用范围 适用于猪瘟活疫苗制品的外源病毒检验。三、检验1. 注意事项 1.1检验所用原材料应符合有关规定。如所选细胞应纯净无污染。1.2荧光染色检查法使用直接免疫荧光抗体检测和间接免疫荧光抗体检测均可，直接免疫法是直接用fitc标记的单特异性抗体荧光检测，间接免疫法是用单特异性抗体和fitc标记的二抗进行荧光检测直接。该sop介绍直接荧光操作法。1.3严格无菌操作，防止交叉污染。2.仪器设备与试剂及物品准备2.1仪器设备 恒温培养箱、co2培养箱、低速离心机、普通显微镜、荧光显微镜、水浴锅等。2.2试剂

2、 0.25edta胰酶溶液、mem营养液、pbs（ph7.2）、ppv荧光多抗、bvdv荧光多抗（北京兰伯瑞生物技术有限公司）、灭活胎牛血清、双抗（100ug/ml）、0.2豚鼠红细胞悬液、0.2鸡红细胞悬液、吉姆萨染色剂等。2.3阳性对照用毒种 牛病毒性腹泻病毒/粘膜病病毒（bvdv）：oregonc24v（美国）、nadl株（美国）或其它毒株；（现用毒株为oregonc24v）猪细小病毒（ppv）：nadl-2株、7909株或其它毒株；(现用毒株bj-2株)2.4培养液：生长液为含5-10新生牛血清，维持液为含2-3新生牛血清。3.检验步骤3.1复苏vero、mdbk、pk15（或st）细

3、胞，经传代1-2次培养，细胞生长良好，均匀铺成单层，即可用。3.2样品处理 每批样品取2-3瓶。将样品混合稀释至1ml疫苗应至少含10头份。兔源产品由于保护剂和组织的影响，可以5000-8000r/min 10min离心取上清接种细胞，细胞源可以直接接种细胞。3.3接种细胞：取处理好的样品至少10头份/ml，接种已长好的vero、mdbk、pk15（或st）各一瓶，置37吸附1小时，吸附后加维持液置5co2 37培养（如果样品保护剂浓度仍高可能影响细胞生长，可弃去液，涮一次，再加维持液培养）。另设至少1瓶正常细胞对照。3.4样品的培养和继代3.4.1细胞培养3-5天后，将上述每种细胞培养物反复

4、冻融3次后接种于新的相应细胞单层用于继代，同时留样为1代；再次培养3-5天同样接种与留样为2代；最后一次继代培养5-7天后，接种到新的相应细胞单层48孔板中（同步接种），每个样品重复8孔，接种量为0.5ml。同时留样为3代。每次继代均设正常细胞对照。培养期间至少继代1次，待检样品在每种细胞上的总培养时间应不少于14日。最后一次继代的细胞单层数量和面积、培养时间应符合荧光抗体检查法、细胞病变检查法和红细胞吸附性外源病毒检验的要求。（总接种面积不小于6.0cm2）3.4.2培养期观察 培养期间，对细胞培养物进行常规检查，如培养物出现非疫苗病毒引起的细胞病变时，则判为不符合规定；如无细胞病变，培养结

5、束时，细胞单层应按下述方法继续检验。4.检验方法4.1荧光抗体检查法4.1.1所检外源病毒与所用细胞：需要检查：bvdv， 细胞为 vero和mdbkppv， 细胞为 pk15或st4.1.2步骤 对每一种特定外源病毒的检验应包含三组细胞：被检样品最后一次继代细胞培养物；被检样品最后一次继代时（及同步接样时）设立的特定病毒阳性对照，接种量为100-300 faid50正常细胞对照。以上培养5-7日后，弃去营养液，用pbs洗涤2-3次，晾干后用80冷丙酮置2-8固定30分钟，弃去固定液，自然干燥后用相应的荧光多抗进行染色、镜检。直接免疫荧光检查法：将针对所检外源病毒的fitc标记的单特异性抗体（

6、ppv、bvdv荧光多抗）稀释到工作浓度，滴加（50-100ul/孔）到上述固定好的细胞单层上，37作用30-60分钟，pbs洗涤3次，最后在荧光显微镜下观察染色情况。 判定：当阳性对照出现特异荧光，正常细胞无荧光时，如果被检样品出现荧光，判为不合格。如果阳性对照荧光不明显，或阴性对照出现荧光，判为无结果，应重检。4.2致细胞病变检查法4.2.1细胞的选择 vero和pk15（或st）4.2.2步骤 被检样品在上述细胞中培养，最后一次继代的总接种面积不小于6cm2，同时设立正常细胞对照。用吉姆萨染色液对细胞单层进行常规染色，观察包涵体、巨细胞或其他外源病毒引起的cpe。4.2.3 判定 如出现

7、外源病毒所致的特异性cpe，判为不合格；如果疑有外源病毒污染，又不能通过其他试验排除这种可能性时，则判为不合格。4.3红细胞吸附性外源病毒检验4.3.1细胞的选择 vero和pk15或st4.3.2步骤被检样品在上述细胞中培养，最后一次继代的总接种面积不小于6cm2，同时设立正常细胞对照。弃去营养液，用pbs洗涤细胞2-3次。加入适量红细胞悬液（0.2的豚鼠红细胞和0.2鸡红细胞等量混合），以覆盖整个单层表面为准。分别在2-8和20-25放置30分钟，用pbs洗涤3次，在显微镜下观察红细胞吸附现象。4.3.3判定 如果出现外源病毒所致的红细胞吸附现象，判为不合格；如果疑有外源病毒污染，又不能通过其他试验排除这种可能时，则判为不合格。 附：0.2的豚鼠红细胞和0.2鸡红细胞制作方法1.采血：1.1用10ml注射器吸取抗凝剂2ml，对大公鸡进行心脏或翅静脉采血到10ml，采完后尽快摇动注射器，防止凝血。1.2用2ml注射器吸取抗凝剂1ml，对健康豚鼠进行心脏采血1ml，摇动。2. 离心和 配制：将采集的阿氏液抗凝血以1500转离心10分钟，吸弃上清，再加入原体积pbs悬浮红细胞并如前离心洗涤，共离心洗涤4次，直至上清液无色清亮为至。最