山药多糖提取制备工艺的研究

1、山药多糖提取制备工艺的研究 金华职业技术学院毕业论文 金 华 职 业 技 术 学 院JINHUA COLLEGE OF PROFESSION AND TECHNOLOGY毕业教学环节成果 （2011 届） 题 目 山药多糖提取制备工艺的研究 学 院 制药与材料工程学院 专 业 生物制药技术 班 级 学 号 201031100380131 姓 名 指导教师 2011年5月28日 金华职业技术学院毕业教学成果目 录摘 要- 1 -引 言- 2 -1 仪器与试药- 3 -1.1 仪器- 3 -1.2 试剂- 3 -2.2 样品溶液的制备- 3 -2.3 标准曲线的制备- 3 -2.4 山药多糖提取工

2、艺过程- 4 -2.5 山药水溶性多糖提取工艺的确定- 5 -3 结果与讨论- 6 -3.1 山药多糖提取工艺条件的确定- 6 -3.1.1 料液比对山药多糖提取得率的影响- 6 -3.1.2 提取温度对山药多糖提取得率的影响- 6 -3.1.3 提取时间对山药多糖提取得率的影响- 7 -3.1.4 提取次数对山药多糖提取得率的影响- 8 -3.2 山药多糖提取工艺的优化- 9 -3.2.1 正交设计的因素和水平- 9 -3.2.2 试验设计及考察指标- 9 -3.3 醇沉工艺的优化- 11 -3.4 最优工艺实验验证- 12 -4 分析与结论- 12 -谢 辞- 14 -参考文献- 15 -

3、山药多糖提取制备工艺的研究金华职业技术学院生物制药技术 摘 要：目的：对山药多糖水提醇沉工艺进行研究，得出山药多糖的最佳提取工艺。方法：以山药总多糖为指标，采用分光光度法，单因素考察及正交设计试验法，对料液比、提取温度、提取时间、提取次数进行考察；并对醇沉浓度、醇沉时间和醇沉次数进行考察。结果：水提正交试验结果表明，料液比1:15，温度100，时间4h，提取2次为最佳工艺条件。醇沉正交试验表明，醇沉后溶液浓度为80%，时间为12h，醇沉1次。结论：该实验为山药多糖提取工艺的确定提供依据。关键词：山药多糖、水提醇沉、正交设计试验法引 言 山药既是一种珍贵的药用植物，又是一种常见的食物。山药为薯蓣

4、科植物薯蓣(Dioscorea oppositaThunb.) 的干燥根茎1。山药性平,乃补益药中平稳之品。它平和的药性补而不腻,补而不滞,常在临床上收到意想不到的功效。山药是我国传统名方六味地黄汤的主药之一，李时珍在本草纲目中将其功用概括为“益肾气，健脾胃，止泻痢，化痰涎，润皮毛”五个主要方面2。现代医学研究表明,山药具有多种生物活性, 其中多糖被认为是主要功效成分。本研究旨在明确其化学成分以及含量，对山药多糖进行提取，以山药总多糖为指标，确定其制备工艺和质量控制方法，可进一步揭示山药的实用价值、利用潜力和经济价值，采用正交试验优化提取工艺，为山药的深入研究打下基础。山药多糖是极性大分子化合

5、物，易溶于水，不溶于乙醇，常用水作为提取溶剂。多糖水溶液浓缩后，加入95%乙醇，醇沉的醇浓度根据多糖的结构和性质而不同，一般在70%85%的范围内，静置24h后，分取沉淀，然后进行去小分子杂质、去蛋白质、去色素等处理，水层再进行醇沉，沉淀分别用95%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤，60减压干燥。植物多糖的提取一般根据多糖的特性，即多糖是极性大分子化合物，易溶于水或酸、碱、盐溶液，而不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂，其特点是从不同的材料中进行提取，即相似相溶原理。一般工艺是：原料水提离心醇沉干燥粗多糖。这是目前提取多糖最为常用的方法，本文采用水提醇沉的方法进行提取。1 仪器与试药1.1 仪器 旋转蒸发器（

6、RE-52AA 上海亚荣生化仪器厂）；循环水式多用真空泵（SHB III 上海亚荣生化仪器厂）；紫外可见分光光度计(UV-722N 尤尼柯上海仪器有限公司) ；恒温水浴锅（北京永光明医疗仪器）；定量移液器（上海求精玻璃仪器厂）；万分之一电子天平（日本岛津）；电热恒温干燥箱（202-OAB 天津力泰斯仪器有限公司）；离心沉淀器（800型 上海手术机械厂）。1.2 试剂葡萄糖(产地:石家庄和平，批号110401 )、无水乙醇、95%药用乙醇、浓硫酸、苯酚均为分析纯，山药（产地：河南省新乡市，安徽德昌药业饮片有限公司）2 方法与结果2.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥置恒重的葡萄糖适量，置于250

7、mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为0.354mg/mL的葡萄糖标准溶液，备用。2.2 样品溶液的制备精密吸取山药饮片10.00g，加入95%乙醇100回流提取2次（每次1h，100mL），过滤，滤渣分别以1:15的料液质量体积比（mg:mL），100提取4h，过滤。重复提取3次，合并滤液，放至室温离心，除去淀粉沉淀。离心液浓缩至原体积的1/3，加无水乙醇至醇浓度为80%，静置过夜，离心。沉淀烘干后定容于100mL容量瓶，备用。2.3 标准曲线的制备 总糖含量测定方法以苯酚-硫酸法测定，通过精密吸取葡萄糖标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL置于50mL容量瓶中

8、，加入6%苯酚溶液溶液1.0mL，摇匀，加浓硫酸5.0mL，摇匀，放置10min，加水至刻度，摇匀。另取蒸馏水同上操作制得空白溶液，通过波普扫描确定在490nm处测有最大吸收（见图1），测定490nm处吸光度值，以吸光度值为纵坐标，浓度C为横坐标绘制标准曲线见图2。经回归统计，得标准曲线方程A=32.218X+0.0077，r2=0.9949，浓度在0.007080.02124mg/mL范围内与吸光值线性关系良好。图1 紫外扫描图谱表1 标准曲线标准溶液体积mL0.51.01.52.02.53.0溶液浓度mg/mL0.03540.07080.11620.14220.17750.2124吸光度A

9、0.1090.2560.3780.4730.5590.702图2 标准曲线2.4 山药多糖提取工艺过程将山药饮片切碎，加无水乙醇浸泡72h（重复1次），过滤，将滤渣挥干乙醇，再用无水乙醇重复浸泡一次，取滤渣，加水20倍量加热、冷却、离心、沉淀（重复提取3次，每次4h）。合并3次离心液进行减压浓缩，提取浓缩液静置过夜，离心除去淀粉沉淀，取上清液浓缩，浓缩液加无水乙醇至乙醇含量达80%，静置过夜后离心，透析，透析液加95%乙醇至乙醇含量达80%，最后沉淀，沉淀物干燥得山药粗多糖（白色）。工艺流程图见图3:图3 山药多糖提取工艺流程图2.5 山药水溶性多糖提取工艺的确定 选取与山药多糖提取工艺密切相

10、关的4个因素（料液比、提取温度、提取时间和提取次数）做单因素考察，确定山药水溶性多糖的提取工艺。在单因素考察结果的基础上进行L9(34) 正交试验，优化提取工艺。选取醇沉时间、醇沉次数和醇沉浓度3个因素做单因素考察，确定醇沉工艺，进行L9(33 ) 正交试验，对醇沉工艺进行优化。3 结果与讨论3.1 山药多糖提取工艺条件的确定3.1.1 料液比对山药多糖提取得率的影响 取等量山药饮片8份，提取温度设定100，经过4小时提取3次后，对不同的料液比进行提取比较,根据提取效果来确定最佳的料液比4-5。结果见图4。表2 料液比对山药多糖提取得率的影响料液比（g/mL）1:51:101:151:201:

11、251:301:351:40提取率（%）1.22341.53681.76451.58361.38201.11220.78720.6327图4 料液比对山药多糖提取得率的影响 试验结果表明，随着加水量增加，可溶性多糖含量先升高后逐渐降低，在15倍时达到最大值，故加水量选为1：15。3.1.2 提取温度对山药多糖提取得率的影响 取等量山药饮片8份，每份料液比为1：15，经过4小时提取3次后，对不同的温度进行提取比较,根据提取效果来确定最佳的提取温度。结果见图5。表3 提取温度对山药多糖提取得率的影响温度（）30405060708090100提取率（%）0.02560.01760.03680.065

12、20.18550.19360.32190.8798图5 提取温度对山药多糖提取得率的影响 该试验表明温度因素对山药水溶性多糖的提取有显著影响。随着提取温度的升高，可溶性多糖含量逐渐升高，100时达到最大值，故选提取温度为100。3.1.3 提取时间对山药多糖提取得率的影响 取等量山药饮片5份,每份料液比为1：15，分别回流3次，对不同的时间进行提取比较，根据提取效果来确定最佳的提取时间。结果见图6表4 提取时间对山药多糖提取得率的影响时间（小时）12345提取率（%）0.51310.62460.71390.84530.7437图6 提取时间对山药多糖提取得率的影响 该试验结果表明，山药可溶性多

13、糖含量随着提取时间先升高后降低，在4h达到最大值，故选取提取时间为4h。3.1.4 提取次数对山药多糖提取得率的影响 取等量山药饮片4份,每份料液比为1：15，温度设定100，经过4小时提取，对不同的次数进行提取比较,根据提取效果来确定最佳的提取次数。结果见图7表5 提取次数对山药多糖提取得率的影响提取次数（次）1234提取率（%）1.2161.25761.25821.2578 图7 提取次数对山药多糖提取得率的影响 结果可见，随着提取次数增加，山药多糖含量逐渐增加。但2次与3次、4次含量差别不是很大，故从高效提取角度考虑，选取2次为最佳提取次数。3.2 山药多糖提取工艺的优化3.2.1 正交

14、设计的因素和水平 为了提高山药多糖的得率, 采用L9(34)正交表,选用料液比、提取温度、提取时间、提取次数作为考察因素，每个因素拟订3个水平5-6。见表6。表6 因素水平表 水平因素A/料液比(倍)B/提取温度()C/提取时间(h)D/提取次数(次)110 802 12159032320100433.2.2 试验设计及考察指标 取山药饮片9份，每份10g，95%乙醇100回流提取2次（每次1h，100mL），药渣按正交设计方案提取，提取液静置，待至室温离心除去淀粉沉淀，离心液浓缩至原体积的1/3，浓缩液加加无水乙醇至醇浓度为80%。计算多糖得率。结果见表7。表7 直观分析表实验号因素Y(%)

15、A/料液比B/提取温度C/提取时间D/提取次数实验111110.5560实验212220.7542实验313330.6818实验421230.6668实验522310.6901实验623120.7445实验731320.7242实验832130.5940实验933210.6523均值10.6640.6490.6310.633均值20.7000.6790.6910.741均值30.6570.6930.6990.648极差0.0430.0440.0680.108表8 方差分析表 F0.1-1（2,2）=9，=0.1因素偏差平方和自由度F比F临界值显著性料液比0.0032 0.3433.110提取温

16、度0.00320.3433.110提取时间0.00820.9143.110提取次数0.021 22.4003.110误差 0.048 注：=0.1 *表示有显著性差异。 根据方差分析可知，提取温度、时间、次数对山药水溶性多糖的提取影响较大。水提部分四个影响因素的主次顺序为提取次数提取时间提取温度料液比，最佳提取工艺为A2B3C3D2，即采用15倍量水于沸水浴中提取2次，每次提取4小时。 3.3 醇沉工艺的优化 正交设计的因素与水平：根据影响醇沉工艺的因素，选择醇沉时间、醇沉次数、醇沉浓度3个主要因素作为考察因素，每个因素选择3个水平，进行实验，见表9。表9 醇沉工艺因素水平表L9（33）水平因

17、素A/醇沉时间（h）B/醇沉次数（次）C/醇沉浓度（%）1617529280312385表10 醇沉工艺考察实验设计实验号因素Y（%）A/醇沉时间B/醇沉次数C/醇沉浓度%11110.724221220.890231330.668242120.801852230.765362310.647473130.948883210.724093320.7921均值10.7610.8250.699均值20.7380.7930.828均值30.8220.7030.794极差0.0840.1220.129 根据极差分析可知，以多糖得率为指标,醇沉时间、醇沉次数以及醇沉浓度对多糖得率影响不大。醇沉部分三个影响因

18、素的主次顺序为醇沉浓度醇沉次数醇沉时间，最佳提取工艺为A3B1C2。故为节省资源和操作简便，确定醇沉工艺为：醇沉后，溶液浓度为80%，醇沉1次，时间为12h。3.4 最优工艺实验验证 在得出最优工艺条件下，进行平行实验，以保证实验的准确性。条件：同一批号取两个以上相同的样品，以完全一致的条件（包括温度、湿度、仪器、试剂，以及试验人）进行试验，看其结果的一致性。最优工艺的平行实验：取同一批次的山药饮片3份。1号实验，把山药切碎，加无水乙醇浸泡72h（重复1次），过滤，将滤渣挥干乙醇，再用无水乙醇重复浸泡一次，取滤渣，加水15倍量加热（100）、冷却、离心、沉淀（重复提取2次，每次4h）。合并3次

19、离心液进行减压浓缩，提取浓缩液静置过夜，离心除去淀粉沉淀，取上清液浓缩，浓缩液加无水乙醇至乙醇含量达80%，静置过夜后离心，透析，透析液加95%乙醇至乙醇含量达80%，最后沉淀，沉淀物干燥得山药粗多糖（白色）。剩余2、3号实验同上步骤，取得结果见表11。综述所上：经平行实验测定，在最优工艺条件下，多糖得率为0.9565%。表11 最优工艺的平行实验次数水平A/料液比B/提取温度（）C/提取时间（小时）D/提取次数Y（%）平均值（%）11:15100420.95430.956521:15100420.961631:15100420.95354 分析与结论 由图4可知，随着料液比的增加，山药中多糖

20、的含量先升高后下降，在1：15时达到最大值。由图5可知，山药多糖的含量随着提取温度的升高而逐渐升高，且在100时达到最大值。由图6可知，随着提取时间的增加，山药多糖的含量先升高后降低，在4小时达到含量最大值。由图7可知，山药多糖的含量随着提取次数逐渐高，但2次与3次、4次得率差异不大，本着节约能源，提高效益的原则，故提取次数选择2次。 根据单因素考察及L9(34)正交设计结果表明,以水溶性多糖得率为指标，提取温度、提取时间和提取次数对多糖得率有一定的影响。影响因素的顺序为提取次数提取时间提取温度料液比，综合多糖得率，确定最佳提取工艺为：100加15倍量水提取2次，每次4h。提取液加入无水乙醇至

21、溶液醇浓度为80%，醇沉时间12h，醇沉次数为1次。谢 辞 我的论文能够如期完成是在导师悉心的指导下完成的，导师渊博的专业知识，严谨的教学态度，精益求精的工作作风，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。不仅使我树立了远大的学术目标，掌握了基本的研究方法，还使我明白了许多待人接物与为人处世的道理。本论文从选题到完成，每一步都是在导师的指导下完成的，倾注了导师大量的心血。对此，我谨表示最诚挚的感谢！并衷心地祝愿他身体健康，工作顺利！另外，我还要感谢杭州萧山平民大药房给了我实习的机会，让我更好的锻炼自己，充实自己的知识。感谢单位带队老师对我的指导与关照，感谢其他同事的照顾与帮助，是他们让我更有自信的去实践，更相信自己。 本论文的顺利完成，离不开各位老师、同学和朋友的关心和帮助。此外，我要感谢大学所有老师对我三年来的教育和培养。在三年的大学