发酵工程实验报告之果汁澄清

1、YUNNAN NORMAL U NIVERSITY组号： 7-8节第七小组学号： 124120434学院：生命科学学院专业、班级：12生物技术实验课程名称_ 发酵工程实验指导教师及职称唐湘华开课学期20GG 至 2015 学年下学期云南师范大学教务处编印实验名称：（一）特定产物工业生产菌种发酵及应用性质研究实验时间第十三周实验室睿智3-121小组合组是小组成员咼胜全李朝和刘云谣罗光洪张志豪一、实验目的：1、掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法；2、了解酶学性质的研究.二、实验原理：1、理论依据（1 ）、果胶酶概况（2）、果胶酶的酶活测定方法（3）、微生物发酵生产特定

2、产物受培养基成分、培养条件和附加条件等的制约（4）、酶催化反应的进行受多种因素的影响2、果胶酶概况果胶质：是高等植物细胞壁内及细胞壁间的结构性多糖，是一类高分子碳水化合物，它 的存在往往给果蔬加工等工艺带来许多麻烦和损失。果胶酶：是指能分解果胶质的多种酶的总称，广泛存在于高等植物和微生物中。 产生果胶酶的微生物：细菌、放线菌、酵母和霉菌，但目前商品果胶酶多数来自霉菌。果胶酶的应用：主要是用于果胶的分解，在水果加工、葡萄酒生产、麻类脱胶和饲料等 方面有着广泛的应用。3、果胶酶的酶活测定方法粘度降低法：利用粘度计测量在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。脱胶作用时间法：以脱

3、胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。还原糖法（DNS法）:测定在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，水解果胶产生的还 原糖的量。DNS法：根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，后者是一种还原糖，与3，5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜 色呈比例关系，可利用比色法在 540nm进行测定。4、微生物发酵生产产品受以下条件制约：培养基成分：C源、N源、无机盐、水和生长因子培养条件：温度、pH、溶解氧等附加条件：诱导物、表面活性剂等5、酶催化反应的进行受多种因素的影响底物浓度酶浓度温度pH

4、激活剂抑制剂三、实验材料（一）试剂1、酶活测定用试剂和DNS2、新鲜果汁（二）仪器烧杯、三角瓶、试管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、试剂瓶、研钵等；天平、灭菌锅、超净工作台、培养箱、电炉、恒温水浴锅、记时器（精确到秒）、分光光度计等。（三）培养基1、菌种筛选使用2、黑曲霉Asp-2固体发酵用1、菌种筛选使用培养基基本培养基：果胶1%，磷酸氢二钠0.5%，蛋白胨1%，pH4.5，琼脂2.0%。分离培养基果胶0.5%，磷酸氢二钠0.5%，琼脂2.0% , pH4.5（3）发酵培养基果胶1%，磷酸氢二钠0.5%，蛋白胨1%，pH4.5。2、黑曲霉Asp-2固体发酵培 养基菌种斜面培养基（查氏培养基）

5、NaN030.2%K2HP040.1%KCI0.05%MgS040.05%FeS040.001% 蔗糖 3%琼脂2.5%自然pH种子培养基麸皮3.0%，橘子粉2.0%，硫酸铵0.5%,葡萄糖 1%，KH2PO40.1%pH4.5固体发酵培 养基: 5瓶/组麸皮 10g，橘子粉 2.5g，（NH4）SO40.1g（ 0.8% 干料计）葡萄糖0.125g （ 1%干料计），水15ml要求：按组统一配制后分装三角瓶先将（NH4）SO4、葡萄糖用水溶解，再加其它。四、实验方法、步骤及注意事项：（一）固体发酵果胶酶1、菌种准备菌种活化：试管保存菌种一斜面活化一3（60h培养约液体培养：将菌种接种入装有

6、50mL种子培养基的250mL三角瓶内， 30 Q00rpm，培养约40h，备用。2、氮源的选择和选择的氮源添加量对产酶的影响（第一组）选择硫酸铵、蛋白胨、牛肉膏按照1%浓度替换发酵培养基中的蛋白胨，接种 5%液体种 子，培养48小时，测定酶活。在发酵培养基中分别添加 0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5% （按干料计）浓度的已选择的氮源，保持培养基的其它成分不变，在相同接种量（约 5%，即1.5ml ）相同培养条 件下（30 C 60h ）发酵，测定酶活。3、碳源的选择和选择的碳源添加量对产酶的影响（第二组）选择果胶、葡萄糖、橘子粉按照1%浓度替换发酵培养基中的蛋白胨，接种5%液体

7、种子， 培养48小时，测定酶活。在液体发酵培养基中分别添加 0、0.5%、1.0、2%、3.%的选 择的碳源，保持培养基的其它成分不变，在相同条件下接种液体种子（约5%，即1.5ml ）， 相同培养条件下，30 C,发酵，测定酶活。4、培养基含水量对产酶的影响（第三组）在发酵培养基中加入蒸馏水，使培养基中的含水量分别约为 50%、55%、60%、65%和 70% ;保持培养基的其它成分不变，在相同接种量（5%，即1.5ml ）相同培养条件下（30 C， 4860h ）发酵，测定酶活。5、接种量对产酶的影响（第三组）分别以4%、5%、6%、7%和8%的接种量接种果胶酶产生菌于发酵培养基中，在相同

8、的 培养条件下（30 C860h ）发酵，测定酶活。注意：由于接种的是液体菌种，所以在配制培养基时要将接种时多出的水分去掉。6、发酵时间对产酶的影响（第四组）【发酵在相同的培养基、相同的接种量（5%，即1.5ml ）和相同培养条件下（30 C）分另36、48、60、72 和 84h，测定酶活。注意：精确计算时间，准时取出发酵产物。7、发酵温度对产酶的影响（第五组）保持培养基成分和接种量（5%，即1.5ml ）不变，分别在室温、30、37和45 C的温度条件下发酵48 60h ,测定酶活。先把培养箱调到相应的温度!&果胶酶酶活的测定（）待测酶液的制备烘干:把发酵产物倒于平皿中物巒C样品管A烘干过

9、夜；将烘干勺发酵产物用研钵研,量磨细）,样品管B 吸取1. 8mL果胶底物裙液3了 9保温分钟装于塑料一亳升苓中备制备酶液:称取赭1窟彳酶粉,n充分溶解于aiomL（柠檬酸h柠檬酸钠缓冲液确稀释ioo倍）,纱布半4层）过滤去除杂质；加入3inLDNS试剂终止反 应30m in加入3uiLBNS试剂 终止反应如果测定所得OD值不在有效值（0.2遵6）范围内，则相应地卩降低或增大稀释倍数后再进行测定加入0.2呈升待测酶液. 沸水浴煮沸血m流水冷却流水冷却沸水浴煮沸血in（2）嗥胶酶酶活测定方法，混匀0D54Cnm 比色加蒸帽水1亦 混匀OD540nmlL 色0540runhk 色OD= (A+B

10、) /2酶活定义：在pH3.0、37 C条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放1 ymol半乳糖醛酸 所需要的酶量为一个酶活单位U/g。酶活计算公式酶活（U/g ） =A X 5 X KX NX 1000/（ TX W M）A:样品的OD值（平均值）K标准曲线的斜率N:稀释倍数5: 0.2毫升反应液转换为1毫升体积T:反应时间（min ）1000 :转换因子 1mmol=1000 阿。1W:半乳糖醛酸的分子量（212.16g/mol ）M:称取酶粉克数（g）绘制标准曲线的方法先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定 它们的吸光度A。以A为横坐标，浓度c为纵坐标

11、，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。 然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度/便可从标准曲线上找出对应1. 21 0R =099983的被测溶液浓度或含量毀标准曲线的制作精确称取0.100g半乳糖醛酸，用缓冲溶液定容至100ml糖醛酸的标准溶液。标准曲线如下图表所示，制得浓度为i&g/ml的半乳202020 2-.ii.-0 00D.10 0LM 0 300400.500.6D0 700 30 D Koom（3 ）注意事项试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或 DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面 下，

12、连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头！精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；实验结果的记录与分析9、仪器的使用恒温水浴锅分光光度计烘箱移液枪UV20GG型分光光度计的使用注意提前半小时接通电源，打开机器开关使仪器通电，自检；将对照液及测定液分别装入比色杯 3/4体积并用镜头纸擦干外壁，放入样品室； 调节测定所用波长；读数完毕，打开仪器盖板，关闭开关，将比色杯冲洗干净、浸泡于30 %酒精中注意事项1、接种接种方式是液体固体，用灭菌的移液管或 10ml量筒接种或大枪头；接种后振荡接种瓶，使菌种充分与固体培养基混合。2、水浴锅的使用：水量

13、（蒸馏水）要超过试管中的液面3、分光光度计使用时注意：测定 OD在540nm、以对照为参比、测定吸光值4、及时清洗用过的枪头实验准备内容（1）黑曲霉Asp-2固体发酵用的培养基固体发酵培养基：5瓶/组一注意配方等的不同，做好标记！（2）灭菌培养基其它：10ml量筒（纱布和报纸包口）、移液管（塞棉花）等时间：灭菌45min注意事项1、酶粉的选择：同一大组采用同一酶粉进行应用性质的实验！2、水浴锅的使用水浴锅的水量（蒸馏水）要超过试管中的液面各大组“处理时间”这项实验共同在 1个水浴锅中进行3、分光光度计使用时注意OD660nm以蒸馏水为参比测定透光率五、实验报告（一）、实验结果本次实验在菌种分离

14、时，已经分离到能产生果胶酶的菌株，但是在后期的培养过程中， 发生一点点的错误，导致培养出来的菌种没有酶活，也就是实验失败。（二）结果分析从培养的初期来看，实验能得到菌种，说明实验有成功的契机，但是在经过发酵培养之 后，菌株没有酶活，也就是在发酵培养时出现意外，本次试验提醒我们做实验和做事要 仔细认真，步步为营。实验名称：（二）应用发酵制备的酶液进行果汁澄清的应用实验实验时间第十四周实验室睿智3-121小组合组是小组成员咼胜全李朝和刘云谣罗光洪张志豪六、实验目的：了解影响果胶酶对果汁澄清效果的各种因素七、实验原理：1、果胶酶的应用：主要是用于果胶的分解，在水果加工、葡萄酒生产、麻类脱胶和饲料 等

15、方面有着广泛的应用。2、脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。3、次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。4、还原糖法（DNS法）：测定在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，水解果胶产生的 还原糖的量。八、实验材料1、仪器设备：烧杯、三角瓶、试管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、试剂瓶、研钵等； 天平、灭菌锅、超净工作台、培养箱、电炉、恒温水浴锅、记时器（精确到秒） 、分光光 度计等。2、材料：新鲜果汁、NAOH溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲、DNS试剂等等。九、实验方法、步骤及注意事项：（一）待测酶液的制备1、制备酶液：称取1g酶粉，充分溶解于10mL柠檬

16、酸-柠檬酸钠缓冲液（稀释10倍）, 高速冷冻离心（10000转、5min ）去除杂质；2、根据发酵条件优化实验中测定所得 OD值大小，选择酶活最高的酶粉制备酶液。（二）果汁的制备1、水果一清洗一破碎一榨汁2、稀释：用pH3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释至10倍（三）果胶酶的应用性实验一果汁澄清实验1、果汁澄清的基本方法步骤样品A管样品B管空白管步骤1吸取稀释果汁10毫吸取稀释果汁10毫升吸取稀释果汁10毫升升步骤245 C 保温 5min45 C 保温 5min45 C 保温 5min步骤3稀释酶液1mL稀释酶液1mL不加步骤445 C精确保温45 C精确保温30min45 C精确保温30m

17、i n30mi n步骤5离心（5000转，5离心（5000转，5分离心（5000转，5分钟）钟）分钟）步骤6以蒸馏水为参比，以蒸馏水为参比，以蒸馏水为参比，660nm测定透光率660nm测定透光率660nm测定透光率T （透光率）=（A+B）/2何=| T To丨空白为To2、果胶酶添加量对澄清效果的影响（1 , 2组）（1 ）在反应体系中分别加入 0.2、0.5、1.0、1.5和2.0ml的果胶酶液（2）在相同的反应条件（pH3.0 , 45 C）下处理30min，以蒸馏水为参比分别测定透光 率。3、果汁pH对澄清效果的影响（3, 4组）（1） 用 0.25mol/LH 2SO4 和 3mo

18、l/LNaOH 分别调节果汁的 pH 至 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 ;（2） 在反应体系中加入1.0ml的果胶酶液，相同的反应条件（45 C）下处理30min ,以蒸馏水为参比分别测定透光率。4、果汁温度对澄清效果的影响(5 , 6组)(1) 保持反应体系的其它条件(1.0ml的果胶酶液、pH3.0 , 30min )不变，分别在室温(温度计测定)、37 C、45 C、50 C、55 C条件下进行反应30Min;(2) 以蒸馏水为参比分别测定透光率。(四) 注意事项1、水浴锅的使用(1)水浴锅的水量(蒸馏水)要超过试管中的液面(2 )各大组“处理时间”这项

19、实验共同在 1个水浴锅中进行2、分光光度计使用时注意(1) OD660nm(2 )以蒸馏水为参比(3) 测定透光率十、实验结果及分析1、对不同的实验组添加不同的果胶酶的量后得到的结果如下：(表一)果胶酶添加量对果汁澄清的影响酶液量(ml )OD660平均值(T)空白(TO)T-T0 |A管B管0.245.90%74.00%59.95%11.60%48.35%0.539.10%42.70%40.90%12.10%28.80%1.054.30%37.40%45.85%11.40%34.45%1.521.80%9.30%15.55%11.90%3.65%2.047.30%48.90%48.10%12

20、.00%36.10%根据上表格做出的折线图(图一)如下:1宋胶酸那加莹【透光率之差（ T=| T To I）】分析：根据表格数据及折线图中的信息可以看出 T随着酶量的增加逐渐下降，到酶量为1.5ML时突然上升。但是根据理论分析随着酶量的增加厶T的值应该是逐渐上升，直到某 一浓度之后不再增加。出现上图的结果说明实验没有成功，可能的原因有：（1）可能是测OD值时把管号弄混了； （ 2）可能是加酶时出现漏加现象；（3）从表一中A、B管数 据的分布来看，该实验数据的准确性太低，波动大，可信度低。由于种种原因，本次实 验未能找出最适加酶量。2、不同PH的果汁对果汁澄清效果有影响的实验结果如下（表二）果汁

21、PH对澄清效果的影响PH管号OD660平均值（T）空白管（To）r=| tT0 I1.5A19.60%19.50%20.60%1.10%B19.10%2.0A12.10%23.50%20.60%2.90%B35.00%2.5A61.80%64.00%20.60%43.40%B66.10%3.0A74.60%65.50%20.60%44.90%B66.30%3.5A80.40%80.50%20.60%59.90%B80.80%4.0A91.90%93.50%20.60%72.90%B95.00% a40.00%B30.00%_(.：(?A根据表二做出0 00%果汁PH42.40%果叶叶对架汁澄荷嫩 果的影响7.40%【透光率之差（ T=| T To I）】分析：从表二中的数据来看，A、B两管的数值差距不大，可信度较高，从图二可以看出 随着PH的升高不断的升高，当达到一定的高度之后， T又逐渐下降，在PH=4时厶 T的值达到最高为72.90%。也就是说当果汁的PH=4时果汁澄清的效果最好，即最适的 果汁澄清PH为4。建议在今后的实验中用PH=4的果汁进行实验，效果会更好。3、不同反应