脐血制备培训手册.

1、黑龍注天靖干細腮做份有限分司Heilongjiiang Ti日n Qing Stem Cel) Co., Ltd.脐带血制备培训手册湖北省生命源干细胞有限公司SMYSCB、什么是干细胞干细胞(stem cells, SC) 是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell ，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotent stemcell,TSC)、多能干细胞(pluripotent

2、 stem cell )和单能干细胞(unipotent stem cell )。 干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的 潜在功能，医学界称为“万用细胞”、血液基础知识1 血液的功能机体各组织器官营养成分和代谢产物的载体。 人体所需水分、氧及排出二氧化碳的载体。 参与人体免疫功能，防止疾病侵袭。2 .血液的组成加入抗凝剂，离心， 静置30分钟后的情况血饼血液自然凝固血液由有形成分(血细胞等)和血浆组成。血清：血液自然凝固，除去固体部分(血饼)后所获得的液体部分。血浆：血液经抗凝处理，在离心作用后获得的清液部分。除血清所含成分外，还包括蛋白质

3、、 凝固因子等成分。厂血浆血液 血清蛋白一凝固因子红细胞 白细胞-血小板 一 一其他有形成分血饼3 血液细胞构成血液细胞红细胞白细胞白细胞（1）.红细胞：形态和功能:血小板一淋巴细胞单核细胞粒细胞嗜中性粒细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞红细胞为扁圆状结构，中央凹陷，细胞内无核、柔软，可进入比本身直径更小的毛细血管，平均直 径78m。内含血红蛋白，富含铁元素，容易氧化。负责将氧气输送致全身，并将二氧化碳收集至肺部 排出。1五分类正常情况下，红细胞起源于骨髓中红系祖细胞，后者在促红细胞生成素的作用下，分化为原红细胞,经数次有丝分裂而依次发育为早幼、中幼、晚幼红细胞，后者已丧失分裂能力通过脱核成为网织红

4、细胞进入外周血。由网织红细胞再发育成为完全成熟的红细胞。从早幼红细胞开始，已能利用铁蛋白和原卟啉合成血红素，后者再与珠蛋白肽链结合而成为血红蛋 白，幼红细胞越趋向成熟，合成的血红蛋白越多，直到网织红细胞阶段仍能合成少量血红蛋白。一般外周血中网织红细胞的含量不超过1%，网织红细胞中仍残留有RNA，由此可通过流式细胞检测技术进行检测。网织红细胞越成熟，DNA含量越低，由此可计算出网织红细胞成熟程度。（2）.白细胞：白细胞的分类和分群：从严格的意义上讲，只有将白细胞的种类分出淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞的分析才被认可为白细胞分类。除此之外的只能算作白细胞分群。但在国内

5、，白细胞分类和分群的界定并不十分严格。以下是白细胞的分类或分群:小型白细胞（淋巴细胞）大型白细胞（其他白细胞）小型白细胞（淋巴细胞）中型白细胞（单核细胞、嗜酸性、嗜碱性粒细胞）大型白细胞（嗜中性粒细胞）淋巴细胞单核细胞嗜中性粒细胞粒细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞形状和功能：白细胞为球状结构，细胞内有核，直径715m。产生人体免疫机能，直接攻击外来细菌或产5*嗜酸性粒细胞协助产生抗体。(3).血小板： 血液中的有形成分，体积较小，参与凝血和止血。4 血液分析的意义和检验学科的分类在生理情况下，人体内血液各种成分的质和量，反映了机体正常新陈代谢和内外环境的平衡。 在病理情况下，血液成分质和量的变化，

6、除了反映造血系统的病变以外，还能直接或间接地提 示全身或局部组织器官的病变。生物化学和免疫学分析：主要检验血清中的化学成分、传染病抗原、特殊蛋白质等。 血栓与止血分析：主要检验与临床止血和凝血相关的各种血小板因子、凝血因子、血管因子等 项目。血液细胞分析：主要检验血液中有形成分的质和量。5 .血液细胞分析的方法传统方法：以手工操作、普通光学显微镜、计数板等简单器材为主要检测手段。 现代方法：以血液细胞自动分析仪为主要标志。随着细胞化学、组织化学、位相显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、同位素示踪技术、单克隆 抗体等现代技术的运用，血液学研究不断得到新的发展。到20世纪90年代，综合光学、电学、细胞

7、化学原理的血液细胞分析仪代表了当今血液一般检 验技术的发展趋势。三、脐带血干细胞脐带血：宝宝出生并剪断脐带后，于脐带静脉抽取脐带血。脐带血中含有大量的造血干细胞、丰富的间充质干细胞，与人骨髓中的数量相当，且 脐带血干细胞更为原始，具有更强的分化能力，不仅支持造血系统，还可向中胚层和外胚层 来源的组织分化。四、主要设备使用1库尔特全自动血液分析仪悬浮在电解液中的颗粒随电解液通过小孔管时，取代相同体积的电解液，在恒电流设计的电路中导致小孔管内外两电极间电阻发生瞬时变化，产生电位脉冲。脉冲信号的大小和次数与颗粒的大小 和数目成正比。用于血细胞计数。因其属于对颗粒个体的测量和三维的测 量，不但能准确测

8、量物料的粒径分布，更能作粒子绝对数目和浓度的测量。其所测粒径更接 近真实，而且不象激光衍射散射原理受物料的颜色和浓度的影响。库尔特使用流程：第一步：打开电脑，双击“ LIS”图标，出现LIS窗口和登陆对话框。输入用户名 和密码，点击确认进入LIS系统，然后进入检验系统。第二步：打开仪器电源，LIS与仪器通信连接。第三步：主机初始化，开机自检，开机自检通过后，仪器指示灯变绿，仪器处于待 机状态。第四步：测量及结果打印第六步：关机标本检测时，因血液等污染时，可能被病原体感染，因此必须佩戴橡皮手套。（1）将试管倾斜来回晃动，充分混匀待检测的样本。SMYSCB(2) 不要溅出血液样本，顺利的把试管盖取

9、下(3) 将吸液管放进试管里的样本中，不可有气泡。在此状态下按开始开关(4) 蜂鸣器“滴滴”响两声后，当 LCD画面中显示“正在测量”时，就可将试管 取 下。此后，设备进行自动测量，结果显示于 LCD画面上。三、高频热合机SMYSCB使用方法：第一步：打开电源，设备预热10分钟。第二步：调节电压档，调节热合时间旋钮，调节手动挡旋钮。 第三步：将需要热合的管道等擦拭干净，不可残留液体。第四步：用手钳热合管道，当热合指示灯熄灭时，热合结束。第五步：将“工作选项”调到“ 0”档，电压调节到关闭状态四：生物安全柜1新安装或长期未使用等的生物安全柜，使用前必须用超净真空吸尘器或不产生纤维的物品认真进行清

10、洁工作。2 接通电源，将玻璃移门开启至 200mm,按 送风机”按钮启动风机，让风机运行15分钟后再使用。3 在开始操作前，要将所有必需的物品置于安全柜内，以尽量减少手臂进出前面开口的次数，防止干扰内部气流。4 按动 照明”按钮开启荧光灯，开始正式作业。5 安全柜工作腔内部设有两个备用防溅型插座，供实验辅助设备使用，务必在 切断备用 插座电源”的状态下，将辅助设备的电源插头插于 备用插座”再按 插座”按钮接通备用插 座电源。使用结束时，必须再次先按 插座”按钮，及时切断插座电源，然后才能将辅助设备7的电源插头拔出。6 使用结束后，将物品移出安全柜，用75%酒精清理工作台面，按照明”按钮关闭荧光

11、灯。7 保持风机再运行15分钟，待设备充分自净后再关机，关机时，按住 送风机”按钮持续3秒钟以上，可关闭风机。8关闭玻璃移门，按 杀菌”按钮启动紫外灯，安全柜具有 杀菌操作的联锁与定时”功能, 系统在杀菌操作连续运行三十分钟后，会自动关闭紫外灯。9 长时间不使用的生物安全柜应切断总电源。10O风机开关口照明开关O 内部插座电源开关紫外线灭菌开关五：单通道注射泵9SMVSCB|fnipin|i川卩川卩川川Jfor single use 护1. 自动检测注射器规格，适应10ml, 20/30ml, 50/60ml注射器。2. 通过标定，能使用任何厂家生产的符合国家标准的注射器，并能精确地控制注射

12、流量和监控注射过程。3. 能自动识别一次性注射器规格。4. 具有三类工作模式：速度模式、定时模式、体重模式。5. 具有注射器规格识别及显示、注射器参数标定、注射速度设置及显示、预注射 总量设置、已注射量显示、已注射量清零操作、快速注射控制、声光报警提示、 阻塞压力设置及显示、报警音量设置及显示、电源及电量显示等功能。6. 可根据临床需要选择三档阻塞报警声音（高、中、低）。7. 可根据临床需要选择三档阻塞报警压力（高、中、低），并动态地显示注射器压 力。8. 当设置容量注射完成或注射器空时，注射泵自动进入KVO （保持血管畅通）状态O9. 超大屏幕全中文彩色液晶显示器。10. 两种供电工作方式：

13、市电供电和内置可充电电池供电#SMYSCB防护等级：CF,除颤防护，安全性能II级；输液速率：0.01-2000.0ml/h, 次性快速推注速率：1200ml/h; 输液精确度： 土 2.5% （时间：1H,输液体积2ml）;可选用注射器的规格：2-3毫升，5，10，20, 30和50/60毫升，可自动辨认注射器的规格，用注射器编码，可使用6种以上型号注射器;自动计算输液速率：先输入输液量和所用时间；快速推注功能的控制：只需按单键或选择预置的数据可一直保留； 阻塞报警压力限制：3种水平可选择：0.3, 0.6, 1.2bar, 一旦出现压力报警快速推注量会自动减少；预报警：在注射器排空前3分钟

14、，或电池电力耗尽320分钟前； 数据锁功能：使按键功能暂时关闭；六、电子天平校准方法与步骤：1. 准备好校准用的标准砝码并确保称盘空载2. 按去皮键：天平显示零状态11SMVSCli3. 按校准键：天平显示闪烁的CAL XXX （XXX 般为100、200或其它数字，提醒使 用相对应的100g、200g或其它规格的标准砝码）4. 将标准砝码放到称盘中心位置，天平显示 CAL-XXX等待几秒钟后，显示标准砝码的 量值。此时移去砝码，天平显示零状态，则表示校准结束，可以进行称量。如天平不零状态, 应重复进行一次校准工作。称量天平经校准后即可进行称量，称量时必须等显示器左下角的“O”标志熄灭后才可读

15、数, 称量过程中被称物必须轻拿轻放，并确保不使天平超载，以免损坏天平的传感器。清零或去皮清零：当天平空载时，如显示不在零状态，可按 去皮键，使天平显示零状态。此时才 可进行正常称量。去皮：小颗粒物和液体在称量时都需要使用容器，可将容器放在称盘上，按 去皮键, 使天平显示零状态，然后再将装有待称物的该容器放到称盘上， 此时天平显示的结果即为容 器中物体的净重，如果将容器从称盘上取走，则皮重 （即容器的重量）以负值显示，皮重将一 直保留到再次按 去皮键或关机为止。注：使用去皮功能时，容器和待称物的总重不可大于天平的最大称量。八、Thermo RC3BP+ 离心机SMYSCB利粒 +diNiiR t

16、in 叶用时 * MBMMMVBTAtt歼養门+营方vn 奇门Fi輒臺傑沪厦力.、箱井心井吉谕 事3改E他犬糧損护， 贮红文上冏蔚晝怪.杆守金*eSBdBAK噸早，餐週鼻 thf n+tu节常診出蒔粧算乍它矗.H忖鼻梵供理大的用性RC3BP Piui壬債聘事科祇审賈必* 首两子蛮舞的耳瞞心应州.最高转速5,000rpm最大离心力7,277 X g最大容量6X 1000ml，适用于分离6个单联、双联、三联及四联血袋操作规程1使用前30分钟打开仪器电源，预冷至设定温度 10C。2打开离心机盖，取出离心套杯，放入样品，配平后放入离心机。3放好离心机内盖，按压机器外盖，屏幕显示各项都为0,提示盖好。4

17、设置本次离心需要的程序（包括温度、转速、时间），并按“ ENTER键，确认后按“START键，离心机开始运行。5温度设定：在菜单中选择设置中的温度，用数字键盘设定温度.6转速设定：在菜单中选择设置中的转速，用数字键盘设定转速.7时间设定：在菜单中选择设置中的时间，用数字键盘设定时间.8待离心机停止后，按“ OPEN键打开离心机外盖，在打开内盖，平稳取出样品。 在运行中若要紧急停止，按“ STOP键，待离心机停止转动后打开离心机外盖和内 盖。9使用完后关闭电源。九、定容分浆夹1 操作手柄下压并挂在挂勾上，以便打开夹板。2 将血袋缓慢地放在定、动夹板（两块有机玻璃）之间，采血管朝上。3 手柄脱勾，

18、使动夹板慢慢夹紧血袋，动夹板依靠弹簧拉力，使血液的不同成分由上 而下被挤出。4 待血液流出后，达到制备需求，则立刻停止挤压。将手柄拉回，使两有机玻璃分开5 注意事项5.1使用结束后，请不要把手柄一直挂在挂勾上，以免弹簧疲劳。5.2严禁用腐蚀性液体擦洗分浆夹。十、CX21显微镜1 调整光强。1.1将主电源开关打开。1.2转动亮度调整旋纽调整光亮度，选择合适的亮度。旋纽周围的数值代表电压值的大小。2 放置标本（显微镜用标本）。2.1按逆时针方向转动粗调旋转盘降下载物台。2.1掰开载物台的样本夹，自前向后把样本放入载物台。2.3样本放稳后，将样本夹轻轻放回原位。2.4分别转动垂直于载物台的移动旋转杆

19、的上部和下部，使样本前后和左右移动。2.5取下样本方法与放入方法相反。3 聚焦3.1从显微镜的侧面看，按顺时针方向转动粗调旋钮，使物镜尽可能接近标本。3.2 一边看目镜，一边慢慢顺逆方向转动粗调旋钮，使载物台向下移动。3.3看到样本后，用微调旋钮来正确对焦。4 调整瞳距：调整瞳距是调整双眼间的距离，使两只眼睛同时看到一个显微镜像，能防止观察时的疲劳。具体方法是：一边看目镜，一边移动双目镜筒，让左右的视野一致，标识点的位置表示瞳距。5 调整屈光度数5.1以右眼看右侧的目镜，旋转粗、微调旋转盘对好焦距。5.2以左眼看左侧的目镜，旋转屈光度调整环，对好焦距。6 调整聚光镜位置和孔径光阑6.1 一般聚

20、光镜是在上限位置使用，但是在观察视野亮度时不太均衡时，向下微调聚光镜，可获得良好的照明亮度。6.2用聚光镜上下移动转纽将聚光镜拉到最上面。6.3在孔径光阑环上刻有物镜倍率（4倍，10倍，40倍，100倍），观察时将与使用物镜相对应 的倍率放到正面。7 旋转物镜转盘，将希望使用的物镜转到标本（显微镜用标本）的上方8 观察样本在观察样本时，如有需要的话，要不断地进行螺旋纽的粗、微调动，以便更好的观察样本，得出实验的准确性。9 实验结束9.1实验结束后，将物镜转盘旋转一定角度，防止正上方的灰尘落到物镜镜片上，并关闭主电源9.2用显微镜防护套将显微镜套上十一、液氮罐使用过程1将输送管与液相阀相连接，输

21、送管道建议选用真空绝热软管。2将输送管的另一端与用液设备相连接。3打开气瓶上的液相阀。4当输送完成，关上接收装置的阀门，关上气瓶的液相阀，释放输送管中的压力为 零。5从接收装置上卸下输送管。警告：在液体输送前要确保操作者正确戴好防护镜和手套。如果是向一敞开的高处 容器输送时，气瓶内的压力要尽量小，并且有隔离装置防止液体溅出及软管颤 动。十二、干细胞储存罐使用过程1液氮罐只用于盛装液氮，不允许盛装其他液体;2使用前检查容器内部是否清洁干燥；3充液氮前要用少量液氮预冷；4用于长期贮存时，则需要定期补充液氮，补充时机一般应在液氮剩余量为总容量 的三分之一为宜；气相罐液氮量不能超过最底层样本高度。5严

22、禁在容器盖上放置物体和密封颈口；6放进或取出冷冻物品时，要尽量使罐口打开时间短，以减少液氮消耗，也不要把 提筒完全提出来；7严防冲击和碰撞；8严禁用硬物清除颈管内的冻霜，以免损伤颈管。9液氮罐运输时只能立放，不能躺放，为了防止翻倒，须用皮带或其它物品固定，为了缓和冲击，应使用海棉或其它软垫垫底；10液氮运输时，请用运输罐，禁止用贮存罐作运输罐用。11长期存放液氮的房间应开窗通风、换气。十三、程控降温仪使用过程1检查程控降温仪、液氮罐、电脑、打印机是否已经连接。2打开计算机电源。3打开程控降温仪电源开关。4打开杜瓦瓶液相阀门，并保证管道接口连接紧密，无液氮渗漏。5将待冷冻的样本放入箱内冻存架上，

23、冻存架每层仅放置一份。6对照样本中插入测温探针，关上箱门。7在电脑中运行程控降温程序，输入用户名和密码，输入待冷冻样本的编号和冷冻日期。8等样本和箱体温度4C平衡后，按空格继续运行程序。9冷冻结束后关闭程序，打印并存储冷冻曲线，储存的冷冻曲线编号，以便后期查询。10关闭电脑，程控降温仪及杜瓦瓶液相阀门。11清洁程控降温仪。12填写程控降温仪运行记录五、核心试剂1 DMSO二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide或DMSO),无色液体，重要的极性非质子溶剂。它可与许多有机溶剂及水互溶，是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，17SMVSCli减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜

24、对电解质、药物、毒物和代 谢产物的通透性。分子式：C2H6OS分子量：78.12物理化学性质密度：1.1 熔点:18.4-19.0 C沸点：189C2羟乙基淀粉HES增加红细胞膜负电荷，促使红细胞凝集，有效提高红细胞的沉降 速度，从而使红细胞与其他细胞分离。分子式 ：C22H44O17分子量：580.57463液氮液态的氮气。惰性，无色，无嗅，无腐蚀性，不可燃，温度极低。健康危害： 皮肤接触液氮可致冻伤。如在常压下汽化产生的氮气过量,可使空气中氧分压下降, 引起缺氧窒息。氮的沸点是-196r六、工艺流程1. 流程图:#SMYSCB9脐血检测样本信息反馈单10. 脐血储存位置台 账（纸质版、电子

25、版）11. 隔离储存位置台 账（纸质版、电子版） 12细胞出库单隔离储存出库废弃 一;*质控部QA13. 细胞入库入库记 录（纸质版、电子版）14. 脐血储存位置台I账（纸质版、电子版）2. 脐血分离操作1.准备工作1.1. 制备人员进入实验室严格按照人员进出实验室操作规程执行1.1.1. 进入洁净室后，用75%酒精浸泡双手一分钟，并用浸泡过75%酒精的毛巾擦拭工作台面。将手术剪浸泡在酒精筒中备用。棉签和二通开袋后放入专用无菌铝盒中。1.1.2. 生物安全柜上的准备工作按照生物安全柜使用及维护作业指导书执行1.2. 胎盘血接收 1.2.1 打开热合机、电子天平和离心机电源。1.22将三联袋、冻

26、存袋、30mL注射器、10mL注射器放入安全操作盒内，且将离心管、 冻存管、血浆管放在试管架上一并放入安全操作盒内。1.2.3. 在三联袋、冻存袋、离心管、冻存管、血浆管上一一贴上胎盘血编号标签。注意一一 核对，不能漏贴。1.2.4. 制备实验室计数岗位工作人员在传递窗接收胎盘血胎盘血干细胞制备表并核对编号。1.2.5. 将胎盘血一一对应放入安全操作盒内，盖上盖子，在盖子上写上该份胎盘血编号，并 连同胎盘血干细胞制备表将安全操作盒至于推车上。然后在制备工作间进行胎盘 血的分离与制备操作。1.2.6. 在胎盘血干细胞制备表填写胎盘血编号、血型、体积、及制备起始时间。1.3. 取样称重1.3.1.

27、 将采集袋上采血辫里的血液及抗凝剂挤入采集袋内，彻底混匀。1.3.2. 在生物安全柜下，消毒后用消毒手术剪剪开采血辫。1.3.3. 从采集袋中取出约3mL胎盘血于准备好的5ml离心管中。留样前注意核对采集袋上 编号和离心管上编号一致，断管时先用碘伏和75%的医用酒精消毒，再用浸泡在酒精 筒中的无菌剪刀斜面断管。1.3.4. 留样后用止血钳夹住采血辫，并立刻在采血辫的开口处接上二通。1.3.5. 取样后称量采集袋重量，计算胎盘血（含抗凝剂）工作体积。胎盘血工作体积（mL）=（采集袋重量28） /1.06（28为采集袋空袋重量）1.3.6. 将胎盘血工作体积填写在胎盘血干细胞制备表上以及留有血样的

28、离心管上。1.3.7. 按羟乙基淀粉：胎盘血=1: 5的体积比例计算该份胎盘血所需羟乙基淀粉的量，计算 结果填写在胎盘血干细胞制备表上。1.4. 样本计数1.4.1. 造血干细胞计数按胎盘血干细胞计数检测标准操作规程执行19142. 造血干细胞活性百分比计数按活细胞百分比计数标准操作规程执行。143. 有核细胞总数达到3X 108继续制备，低于3X108则放弃制备。1.4.4. 计数后剩余样本送QC进行下一步检测。1.5. 转袋加羟乙基淀粉：1.5.1. 三联袋的准备：将三联袋中含转移管道的血袋编为袋1,剩余200ml袋编为袋2,100ml袋编为袋3,卡死袋1和袋2、袋3间的通道。1.5.2.

29、 核对胎盘血采集袋和三联袋上的编号一致后，无菌连接胎盘血采集袋和三联袋袋1,将胎盘血转入袋1,并注意勿将纤原、血块一并转入袋 1中。1.5.3. 用30ml注射器抽取已计算好的羟乙基淀粉，加入胎盘血采集袋中，清洗采集袋后转入三联袋袋1中。如果采集袋中有纤原和血块，则不洗袋，直接将羟乙基淀粉注入三 联袋袋1中。1.5.4. 将采集袋和三联袋之间的连接通路热合并剪开，彻底混匀袋1中的胎盘血和羟乙基淀粉。混匀时均匀振荡，不可剧烈晃动。1.6. 第一次离心。1.6.1. 离心机使用按大型冷冻离心机使用标准操作规程执行。1.6.2. 保持袋1在离心杯中竖直，无折痕（如胎盘血体积在70-100ml保持袋1

30、在离心杯中倒置，无折痕）。1.6.3. 离心转速设置为：500rpm，时间6分钟，温度10C。1.6.4. 离心完成后小心地取出离心杯中的三联袋袋1,将其放在血浆夹中，静置10min。1.7. 第一次分离（去除红细胞）：1.7.1. 用止血钳夹住袋1和袋2之间的转移管控制流速，缓慢地将血浆和白膜层挤入袋2中。1.7.2. 当上层血浆和白膜层全部放入袋 2后，再分离大约10mL红细胞进入袋2中。1.7.3. 将袋1中残余的白细胞挤入袋2中，分完后用止流夹夹住三联袋转移管。1.8. 第二次离心1.8.1. 离心机使用按大型冷冻离心机使用标准操作规程执行211.82 离心转速设置为：1200rpm、

31、温度10C，离心11分钟。1.83 离心完成后小心移出离心杯，取出三联袋将袋2放入血浆夹中，避免振荡。1.9. 第二次分离（去除多余血浆）.1.9.1. 用止血钳夹住三联袋转移管，控制流速，让上层血浆缓慢流入三联袋袋3中，注意避免让白膜层放入袋3中。1.9.2. 用30mL注射器粗略测量袋中干细胞悬液体积，体积较小时补入血浆，使干细胞悬液 体积控制在2024mL左右。1.10. 分离后取样1.10.1. 无菌条件下从装有干细胞悬液的袋中取 0.5mL （810滴）干细胞悬液，留样到无菌的 5ml留样管中，用于细胞计数，剩余样本送QC做集落细胞培养、CD34+ffl胞检测。1.10.2. 造血干

32、细胞计数按胎盘血干细胞计数检测标准操作规程执行，有核细胞回收率在70%以上，继续制备，有核细胞回收率在 70%以下，按4.4.6-4.4.10重新分离制备， 达到60%则按正常继续下一步工序冻存，未达到60%按不合格样本处理废弃。1.10.3 .造血干细胞活性百分比计数按活细胞百分比计数标准操作规程执行。1.10.4. 从装有血浆的血浆袋中留0.5ml血浆到5ml留样管中，用于有核细胞计数时的稀释。1.10.5. 留3ml血浆到5ml留样管中，用于病毒检测。1.10.6. 留1.8ml血浆到2ml留样管（2支）中，用于长期保存。1.10.7. 取20mL血浆，无菌接种到需氧和厌氧细菌培养瓶中。

33、1.10.8. 用30ml注射器准确测量干细胞悬液体积，并填写在胎盘血干细胞制备表上及干 细胞悬液的留样管盖上。1.10.9. 由制备实验室计数岗位工作人员，核实样本后填写制备实验室与造血干细胞培养室 样本交接表、制备实验室与HLA检测室样本交接记录、制备实验室与病原微生 物检测室样本交接记录。1.11. 加冻存保护剂1.11.1. 用10ml注射器按冻存保护剂：干细胞悬液=1:4的量抽取已配置预冷的冻存保护剂，将10mL注射器保留于装干细胞悬液袋开口处，将其置于4C冰箱中静置15分钟。冻存保护剂用量记录在胎盘血干细胞制备表上1.112注射泵的使用按注射泵使用作业标准操作规程执行1.113冻存

34、保护剂的添加设定速度为15ml/h。1.11.4. 加样起始和终止时间记录在胎盘血干细胞制备表上381.12.1. 无菌条件下用注射器量取干细胞悬液注入冻存袋，每个冻存袋最大装量不超过mLo尽量排空袋内空气，热合冻存袋上小管，并留两段样管，认真准确填写该份干 细胞标签，核对胎盘血编号、血型、冻存体积和制备日期等信息无误后，将标签装入 冻存袋抽真空后装入冻存盒。1.12.2. 分别留样0.5mL于两支冻存管1.12.3. 量取的干细胞悬液体积记录在胎盘血干细胞制备表上。核对冻存袋、冻存管、冻存盒编号，然后交给程控室填写制备室与程控室样本交接记录。操作结束后，严格按照洁净实验室清场及清洁操作规程进行清场七、质量标准项目标准有核细胞总数渕X108个有核细胞活率边5%母亲HIV、梅毒等感染的历史无母血样本和脐血样本的HIV-I/II抗体、梅毒血清、乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎、巨细胞病毒反应阴性集落有流式检测CD34有微生物检测阴性25SMYSCB八、脐血冻存操作1. 胎盘血干细胞的程控降温应该按照胎盘血干细胞冷冻保存流程要求进行。2. 接到程控通知后，预定干细胞冻存存放的位置，在胎盘血