毕赤酵母产木聚糖酶实验方案(最终)

1、重组毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶培养实验 一、实验目的 1) 熟练摇瓶发酵的操作流程和无菌操作技术。 2) 掌握细胞浓度、产物浓度的表征和测定方法。 3) 熟悉测定生长曲线和产物生成曲线的方法。 二、毕赤酵母简介 甲醇营养型毕赤酵母 (Pichia pastoris) 表达系统是 80 年代初被开发和研制的一 种新型酵母表达系统。40年前，Ogata等人首次发现有些酵母 能够利用甲醇作为唯一 的碳源和能源进行生长 。随后，甲醇营养酵母作为 潜在的单细胞蛋白 (single cell protein, SCP) 来源立即引起广泛关注，最初将其作为高蛋白的动物饲料在市场上销 售。在20世纪70年代，Ph

2、illips Petroleum公司开发出毕赤酵母利用甲醇生长的培养 基、发酵操作手册和高密度连续培养生产工艺 。 70 年代的石油危机导致了甲烷价格 的急剧上升， 与此同时， 动物饲料蛋白的主要替代源大豆价格的下降， 导致利用 甲醇生产 SCP 在经济上已不再合适。 在以后的 10 年中， PhiLLips PetroLeum 公司与 SIBIA 公司合作开发利用 毕赤酵母作为生物体表达外源蛋白 的研究，研究人员 分离了 醇氧化酶 (alcohol oxidase, AOX) 的基因和启动子，构建了表达载体和菌株，开发了 毕赤酵母基因操作相关技术 。成熟的 SCP 发酵方法的开发，加上醇氧化

3、酶强启动子 的可调控表达特性，极大地影响着外源蛋白在毕赤酵母中的高水平表达。 1993 年， Phillips Petroleum 公司委托 Invitrogen 公司代理毕赤酵母表达系统产品。 毕赤酵母能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶 AOX 甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为 碳源的培养细胞中则检测不到 AOX 。 AOX 的合成是在转录水平调控的。 其基因启动 子具有明显的调控功能， 可用于调控外源基因的表达。 此调控作用是由一般碳源抑制 /解抑制及碳源特殊诱导机制控制的。 外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态， 而在培养液中

4、加入甲醇后， 外源基因即被诱导表达。 巴斯德毕赤酵母中存在着一种称 为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。 Targeted Protein CO 2 CH 3 与大肠杆菌等原核表达系统相比，毕赤酵母作为一种低等真核生物， 除了具有遗 传操作简单、细胞生长快、易于培养等原核生物的特点外，又具有真核生物完整的蛋 白表达、正确加工和修饰功能，能有效克服大肠杆菌系统表达蛋白过程中存在的不足； 而与高等哺乳动物细胞相比，又具有产量高、培养成本低、产物的分离纯化简单等优 点。因此，毕赤酵母表达系统因其具有表达效率高、外源基因遗传稳定、易实现高密 度培养、产物可分泌和蛋白翻译后加

5、工等众多其它表达载体所无法比拟的优点，已成 为近年来极受青睐的外源蛋白表达宿主， 受到越来越多的重视和利用。截止2005年, 已有500多种外源蛋白通过毕赤酵母表达系统得到克隆表达，这些外源蛋白产品涉及 食品、饲料、纺织和医药品等关系国计民生的多个行业。 然而，要实现众多新的外源蛋白产品在工业发酵罐水平下大规模商业化生产，除 了构建高效、稳定的毕赤酵母生产菌株外，利用过程控制的方法和手段，最大限度地 提高生物反应器中基因工程菌的总生物量，发挥菌种的最大生产潜力，提高单位体积 培养液中目标蛋白的表达水平是实现大规模、 商业化重组蛋白生产、提高生产效率的 一个关键因素。 6 / 6 三、毕赤酵母生

6、产表达外源蛋白的发酵过程 Tibk 2Pichta pastarn strains Strain Genotype Application G5115 hl34 Selection of expression vectors containing HIS4 |x-33 Wild type Selection of Zeocrn-resisiant expresston vectors KM71 hfs4t aoxh:ARG4t arg4 Selection of expression vectors containing HIS4 to generate strains with Muf ph

7、enotype KM71H aoxJ .ARG4f arg4 Selection of Zeocin-reslstant expression vectors to generate strains with Muts phenotype SM01168 /j/5 pep4 Selecilon of expression vectors containing HI54 to generate strains without protease A activity SMD1168H Selection of Zeocin711-resistant expression vectors to ge

8、nerate strains without protease A acTh/lty 一般而言，毕赤酵母高密度流加培养生产表达外源蛋白过程由甘油分批培养、甘 油流加培养和甲醇诱导表达三个不同阶段构成。 甘油分批培养的目的是为了积累一定 的生物量，同时抑制AOX启动子及外源蛋白表达；甘油流加培养是通过限制性的甘 油流加，进一步增加生物量，尽可能地获得高细胞浓度，同时解除过量甘油对AOX 启动子的抑制作用，为细胞进入诱导期作准备；甲醇诱导表达阶段是通过添加诱导剂 甲醇，实现AOX高水平转录和外源蛋白的高效表达。 3 二 Gn interest | TI 四、木聚糖酶简介 木聚糖是植物细胞壁的主要成

9、分之一，属于非淀粉多糖。作为半纤维素的一种, 在自然界中是含量仅次于纤维素的可更新多糖， 存在于各种陆生植物的几乎所有部位 它从仅由伕1, 4糖苷键连接的多聚糖线形分子到以 a糖甘键形成取代基支链的高度 分枝的异质多糖，结构变化的范围很大。通常，木聚糖以异质多糖形式存在并与纤维 素结合在一起。木聚糖酶是木聚糖的专一降解酶。属于水解酶类，包括内切木聚糖酶、 外切木聚糖酶和木糖苷酶三种。内切木聚糖酶能随机切断木聚糖主链上的木聚糖苷 键，生成分子量不同的木寡糖；外切木聚糖酶则从木聚糖非还原性末端切下单个的 D-木糖；而木糖苷酶则水解木寡糖生成 D-木糖，且仅能水解木二糖。三者酶解作用 产生的D-木糖

10、可以被动物吸收和利用。近年来对木聚糖酶的研究发现，它应用于饲 料中提高了饲料营养价值， 突破了饲料资源开发利用的局限， 增强了动物的生产与抗 病能力，减少了动物排泄物造成的污染，作为一种环保添加剂，在发展环保型畜牧业 中具有十分重要的意义与价值。 五、毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶实验方案 1. 培养基 种子培 养基 (g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20。 甘油生长培养基(g/L):甘油 20 mL/L，MgSO4 1, K2SO4 1, (NH4)2SO4 5, CaSQ 0.1, H3PO4 2% (v/v)， PTM1 10 mL/L， KOH 20， pH 6.0。 甲醇诱导培养基(

11、g/L):甲醇 10 mL/L，MgSO4 1，K2SO4 1, (NH4)2SO4 5, CaSC4 0.1, H3PO4 2% (v/v)， PTM1 10 mL/L， KOH 20， pH 6.0。 PTM1 组成(g/L): CuSO4 5H2O 6g, Nal 0.08g, MnSO4 H2O 3g, Na2MoO4 0.2g, H3BO3 0.02g, C0CL2 0.5g, ZnCL2 20g, FeSQ 7H2O 65g, H2SO4 5mL,生物素 0.2g 培养基配置要求: 1) KOH 等其它试剂溶解后在灭菌前加入； 2) PTM1、调pH用氨水和甲醇在灭菌后、接种前添加

12、。 3) 调 pH 用氨水的用量需提前确定。 2. 操作步骤 如图 1 : 菌株培养皿活化(30 C , 2-3d) 挑取活化后菌株于种子培养基 250mL 摇瓶种子培养(30 , 220rpm , 24h) 每瓶种子培养基体积25mL 以10% ( v /v)接种量吸取2.5mL活化种子培养液于 甘油生长培养基 250mL摇瓶甘油生长培养(30C，220rpm，24h) 每瓶甘油生长培养基体积25mL 离心(2000rpm x 2min)收集菌体，将菌体转入 等体积诱导培养基中进行诱导培养 250mL摇瓶甲醇诱导培养(30 , 220rpm) 每瓶甲醇诱导培养基体积25mL 1 每12h取样

13、检测菌体浓度、离心(8000rpm x 5min)后 测上清液总蛋白浓度； 每24h补加甲醇1% (w/v);诱导培养共 72h ( 3d) r 发酵结束，清洗实验仪器，撰写实验报告 图1毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶实验操作流程图 3. 分析检测 1) 细胞浓度的测定 采用比浊法，使用紫外分光光度仪进行测定。将从摇瓶中所采集的样品经适当稀 释(控制吸光度在0.1-0.7),测定其在600nm下的吸光度OD600。 2) 发酵上清液样品蛋白浓度测定(考马斯亮蓝比色法) 原理 考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为 青色。蛋白质含量在01000mg范围内，蛋白质-色素

14、结合物在595nm下的吸光度与 蛋白质含量成正比，故可用比色法测定 A595。 试剂配制 (1)标准蛋白质溶液 称取100mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至 100mL， 制成1g/L的原液。 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50mL 90% 乙醇中，加入85%(m/v)的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常 温下可放置一个月。 操作步骤 标准曲线的制作 取6支带塞试管，编号后，按下表所示加入相应试剂: 操作项目 管 号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质溶液（mL） 0 0.2 0.4 0. 6 0.8 1.0 蒸馏水（mL） 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 G-250 试剂(mL) 各5 蛋白质含量 （g） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 盖上塞子，摇匀。放置2min后在595 nm波长下比色测定（比色应在1h内完成）。 以牛血清白蛋白含量（g）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。 发酵上清液样品制备及检测 吸取经适当稀释的待测发酵上