神经肌肉组织活检常用方法和步骤.doc

1、神经肌肉组织活检常用方法和步骤肌肉活检样品取材和送检注意事项一般原则1. 通常使用活组织切开检查法获取肌肉组织。2. 对于具有不协调病理学功能障碍患者，切开活组织检查非常必要，例如多发性肌炎。3. 烧伤、缝合或磁夹部位的肌肉组织不能取样送检。4. 细针穿刺肌肉组织活检可以减少病人的损伤，但也可能会取样不全，丢失肌肉斑片或肌外膜组织。5. 尽可能在同一活检取材位置获取数个肌肉样品，特别是对于多病灶疾病，炎性肌病，需要做代谢分析的肌病可疑患者。肌肉样品送检1. 肌肉样品在湿盐水纱布中可保存几个小时，注意肌肉不应该浸在盐水、固定剂或其他液体中，同时样品须存放于凉爽处。2. 样品不能及时送检时可用充足

2、的干冰保存过夜。肌肉样品冷冻与保存1. 样品经异戊烷予冷器处理冷冻在-160液氮中，也可使用丙酮和干冰的混合液冷冻，肌肉冷冻后最好密封贮存在-70，防止酶活性和水分丢失，肌肉样品在液氮或-70冰箱中可长期保存。2. 经上面方法处理的标本肌肉纤维形态好，光镜检查时可获得大多数诊断信息。3. 为了避免人为现象，送检样品冷冻处理时应该迅速电镜样品固定1. 部分样品固定于4%戊二醛，固定的肌肉组织多用塑料包埋剂包埋。2. 电镜分析可以很清楚显现肌膜毛细血管。石蜡包埋材料1. 石蜡包埋的材料有利于炎症和炎细胞形态观察，但是石蜡切片肌纤维的形态较差。2. 福尔马林固定、石蜡包埋切片无法进行对于某些组织化学

3、和免疫组织化学染色，因此为了满足诊断需要，多数肌肉活检样品需要立即进行冷冻保存或新鲜标本送检。3. 需要石蜡包埋切片的标本应用福尔马林固定。病理实验室肌肉活检样品常规处理方法骨骼肌活检，应尽量避免出现人为现象。根据检查的目的进行必要的处理。标本处理原则上要满足组织化学、电镜和生物化学检查的要求。例如，线粒体异常需要另外保留分离线粒体的样品。如果需要做去皮纤维（skinned fiber或破膜纤维）检查，需要将标本保存在缓冲液中。组织化学检查活检的肌肉标本要用生理盐水浸湿的纱布包裹，放入玻璃瓶内，纱布应该稍微挤干些，避免水分过多，水分过多容易肌肉膨胀。样品直接暴露在空气中很容易干燥。干燥的样品肯

4、定会出现人为现象，影响制片和诊断。操作过程中尽量避免产生人为现象。一般活检的肌肉组织（直径5mm，长度1cm左右），固定于软木塞上。软木塞可选用小瓶塞（直径11.5cm）将肌肉组织竖立在软木塞上，用托辣甘树胶（黄蓍树胶）直立固定肌肉，切片时使呈横断面。注意不要将肌肉完全包埋在黄蓍树胶中。肌肉组织需要骤冷冷冻，不然会产生冰晶。肌肉组织的细胞比较大，特别容易产生冰晶。含有冰晶的肌肉组织染色后细胞内会出现大小不等的空泡。为了快速冷冻，一般使用液氮（-160），丙酮、干冰混合液（-90）。如果将组织直接放入液氮内组织周围产生大量的汽化液泡，产生热隔断效应，会延迟冷冻速度。所以现在的方法是先将产生气泡较

5、少的异戊烷冷却于液氮中，再将组织放在充分冷却的异戊烷中进行冻结。100ml烧杯在颈部系上牵绳，往烧杯中加6070ml异戊烷，将烧杯轻轻放入液氮中。为了使异戊烷冷却均匀，用搅拌棒或镊子不断搅拌异戊烷，开始时液氮因激烈汽化而冒出白烟，而后逐渐减少。异戊烷充分冷却后，在烧杯中产生白色结晶。用大镊子夹住软木塞，迅速置入异戊烷中，迅速左右轻柔地晃动。托辣甘树胶粘附固定肌肉目的就是在充分冷却的异戊烷中轻柔细微地晃动。如果将组织静置在异戊烷中，组织周围异戊烷的温度升高，包裹在组织周围，不能迅速彻底冻结，组织容易形成冰晶，组织轻微晃动冷冻液充分流动，使组织迅速冻结，很难形成冰晶。在异戊烷中冷冻20-30秒钟。

6、移入放有干冰的箱中，放置1小时，使组织周围的异戊烷挥发干净。放入能密封的塑料袋或玻璃瓶中避免组织干燥，置-70冰箱中保存。-70以下密封保存最少可保存1年，不会影响组织化学检查结果。我们观察保存10年以上的标本，染色后的效果和新鲜组织没有明显差别。恒温冷冻切片冷冻切片机内部的温度-25-20为宜。低于-25时，肌肉过硬，容易出现横皱，高于-20时含脂肪、结缔组织的肌肉伸展不良。容易出现皱褶现象。最好在载玻片粘贴23行连续切片的组织。冰冻切片室温保存23天进行任何染色都不会使活性降低，但室温保存5天以上，ATPase染色或Phosphoryase(磷酸化酶)染色效果较差。另外，改良Gomori染

7、色法最好在切片当天进行。肌肉组织活检冷冻步骤用品1. 液氮2. 异戊烷Isopentane (2 methyl butane)3. 长把手镊子4. 两个金属容器5. 手套6. 一次性软木塞安全与防护注意：异戊烷非常易燃，不要让该材料到达室温，放入液氮时使用防护眼镜。试剂配制7%托辣甘树胶（Gum Tragacanth）托辣甘树胶7g蒸馏水100ml麝香草酚5粒托辣甘树胶加入蒸馏水中溶解，再加入5粒麝香草酚，室温搅拌。注：托辣甘树胶非常难溶解，溶液可放在室温间断搅拌。配制后4保存，保质期6个月。(口香糖的主要成分为托辣甘树胶，口香糖用开水或温水浸泡5min，然后再用蒸馏水几次，用清洗后的口香糖代

8、替托辣甘树胶使用，用于粘附固定组织效果并不受影响。口香糖的使用方法仅本人试用，主要顾虑是否会影响PAS染色，口香糖的使用需要更多的实践检验)。肌肉冷冻步骤1 放适当量的托辣甘树胶于软木塞上，将病人姓名和病理编号写到软木塞或贮存肌肉样品的容器上。2 将肌肉组织放在托辣甘树胶中（肌肉组织需要暴露1/3或1/2托辣甘树胶之上，不要完全埋到托辣甘树胶中）。肌肉埋入的方向垂直，肌丝横断面向上（切片为横断面）。3 准备一个100ml小烧杯装入6070ml异戊烷，用规格为700mm的滤纸包住小烧杯的口，再用橡皮筋扎住小烧杯周边的滤纸小心放入液氮中，不要将异戊烷浸到液氮中，让异戊烷降到-140，异戊烷下面冻成

9、固体上面呈液态时即可开始冷冻。4 用长镊子夹住软木塞将准备好的肌肉组织朝下浸到异戊烷中迅速冷冻，并在异戊烷中轻轻地晃动10秒左右，加快冷冻速度，避免形成冰晶。5 用镊子夹住软木塞不动维持20秒钟，（较小于0.3cm的组织5秒钟）冷冻过程中不要将肌肉组织离开异戊烷，直到组织冷冻完成。6 小心将冷冻的组织包埋块拿出来，迅速放入预冷的容器中密封贮存或及时做冰冻切片。或在-70以下无限期保存。7 冷冻后的异戊烷回收到原容器中，盖紧瓶盖，4冰箱储存，冷冻肌肉组织的异戊烷可以反复使用，并不影响冷冻效果。异戊烷易挥发，易燃，使用是应注意。冰冻切片操作步骤1. 防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常

10、用毛笔或柔软的纸张清除残余组织碎片。必要时每切完一张切片后就用纸擦一次。因为切片时组织很容易附贴在防卷板和切片刀之间，如果有残余的包埋剂粘附切片刀或放卷板上，切片容易出现皱折，或组织片断裂，很难获得完整的切片。2. 如果几个病例同时做冰冻切片，应将组织分别放于不同的支承器上，放到冷冻台上冷冻，然后跟据不同病例的编号，按顺序进行切片，并在切片上标记该组织的编号。防止张冠李戴。良好的工作习惯，周到的工作计划，能够有效提高工作效率，使工作忙而不乱。3. 切片时发现组织冷冻过度，可将冰冻包埋的组织块连同支承器取出来，在室温停留片刻，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，还可以把冷冻温度点稍微升高一点

11、。来缓解冷冻过度的程度，让组织尽快达到合适的切片温度。4. 用于附贴冰冻切片的载玻片，室温下应用，不必放入冷藏或冷冻。因为附贴切片时，室温下的载玻片与冷冻箱中的切片有一定的温差，当温度较高的载玻片与温度较低切片接触时，冰冻切片很容易贴到载玻片上。而冷藏或冷冻过的载玻片就不容易贴牢，需要提高温度才能贴牢。切片附贴时容易产生气泡。5. 肌肉活检Gomori三色和改良还原型辅酶四唑蓝还原酶染色法组织切片不需要固定。其余染色方法根据所这证实的组织成分选用最佳固定液固定。肌肉活检样品的染色方法改良还原型辅酶I四唑蓝还原酶（NADH-TR）氧化酶组织化学染色法固定：不需要固定切片：冰冻切片10um试剂配制

12、：染色液还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）-Sigma N8129 8mg 硝基四唑氮蓝(Nitro blue tetraolium-Sigma N6876)10mg0.2mol Tris HCl缓冲液pH7.410ml二甲亚砜（DMSO）0.51ml以上试剂临用前新鲜配制，配制方法将NNADH，NBT，Tris-Hcl混合后加入DMSO然后用玻璃棒搅拌23分钟，过滤后使用。根据上面配方我们在应用时进行了一点变通下面是我们采用的配制方法：A液还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）-Sigma N8129 8mg 0.2mol Tris HCl缓冲液pH7.4 5ml还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷

13、酸（NADH）溶解于Tris HCl缓冲液中。B液硝基四唑氮蓝(Nitro blue tetraolium-Sigma N6876)10mg0.2mol Tris HCl缓冲液pH7.4 5ml硝基四唑氮蓝(Nitro blue tetraolium)溶解于Tris HCl缓冲液中。C液二甲亚砜（DMSO）10ulA液和B液分别分装到EP管中，每管50ul，-20储存。临用时室温解冻， A液50ul和B液50ul混合再加入C液10ul。可以染12张肌肉组织冰冻切片。长期（6个月）-20储存染色不会产生任何影响。这种变通可以免去每次染色前称量繁琐过程。染色步骤1. 冰冻切片放入湿盒中滴加染色液置

14、37恒温箱1020mins。2. 流水冲洗1min。3. 蒸馏水洗3次。4. 甘油-明胶封片。结果：基质网和线粒体呈紫蓝色，型肌纤维比型肌纤维颜色黑些，血管壁同时也被染色。GOMORI 三色法染色步骤原理Gomoris一步三色法是原生质染料（铬变素2R）与结缔纤维（固绿FCF）在钨酸液中加入了冰醋酸一种联合染色样品要求迅速冷冻人横纹肌（利用前面提到的异戊烷冷冻法）方法固定 不需要，使用速冻的组织技术方法 速冻的组织经恒温冷冻切片机上切1016微米，附贴于盖玻片或载玻片上，按需要决定切片数量。设备品 染色架 染色碟 染色缸 镊子 乳胶手套试剂1. 冰醋酸（Glacial Acetic Acid

15、-Fisher A507-500, CORROSIVE store at room emperature）。2. 铬变素2R（Chromotrope 2R - Sigma C3143, IRRITANT, store at room temperature）。3. 去离子水。4. 固绿FCF（Fast Green FCF - certified, Sigma F7258,GLOVES AND MASK REQUIRED, store at room temperature）5. Harris苏木精染液6. Permount - Fisher SP15-100, FLAMMABLE HEALTH

16、 HAZARD7. 磷钨酸 游离酸- Sigma P4006, CORROSIVE, store at room temperature8. 乙醇9. 二甲苯溶液1. Gomoris trichrome stain铬变素2R 0.6g固绿FCF 0.3g磷钨酸 0.6g去离子水 100ml冰醋酸 1.0ml使用1N氢氧化钠调pH至3.4，室温保存，液体1周内有效。2. 0.2%冰醋酸去离子水 100ml冰醋酸 0.2ml3. 50%乙醇乙醇50 ml蒸馏水 50 ml4. 70%乙醇乙醇 70 ml蒸馏水 30 ml5. 80%乙醇乙醇 80 ml蒸馏水 20 ml6. 950%乙醇乙醇 95

17、 ml蒸馏水 5 ml染色步骤（Staining Procedure）1 将切片插入染色架上2 Harris苏木精染5min3 自来水冲洗min4 Gomri 三色液染色10min5 0.2%醋酸浸几次要充分分化6 直接用95%乙醇洗7 继续用上行乙醇液（95%2,100%2）脱水8 二甲苯透明（34）9 中性树胶封固，并标记切片结果细胞核红色-紫红正常肌肉肌原纤维具有不同的绿色A和I折射带Itermyofibrillar muscle membranes: Red间质胶原 绿色改良Gormori三色染色法此染色法对线粒体肌病和先天性肌病的诊断非常有价值。Gormoris液A液变色酸2R0.6

18、g固绿FCF0.3g磷钨酸0.6g冰醋酸1ml蒸馏水99ml用1M氢氧化钠调pH3.4B液冰醋酸0.2ml蒸馏水100ml组织样品肌肉组织经防冰晶处理后，冰冻切片不固定，切片5-10微米，肌纤维横切。染色步骤1. 冰冻切片，室温下晾干切片。2. 用Harris苏木精染5mins。3. 蒸馏水洗。4. 切片放入A液中染10mins。5. 用B液冲洗切片几秒钟。6. 乙醇脱水。7. 二甲苯透明，树胶封固。结果：核蓝色型肌纤维绿色带有红色型肌纤维绿色说明：1. 两型肌纤维都是绿色，但型肌纤维含有更多红染色颗粒物质而带有红颜色。2. 此方法是一种改良Gormori三色染色法。PAS（Periodic

19、Acid Schiff）染色方法简述：该方法用于福尔马林固定石蜡包埋切片的肝、心脏和骨骼肌组织中的糖原检测，还可以用于冰冻切片，糖原，粘液和真菌被染成紫色细胞核被染成蓝色。固定：10%福尔马林。切片：石蜡5微米试剂配制：1. 0.5%过碘酸水溶液过碘酸0.5g蒸馏水100ml2. Schiff 试剂碱性复红（CI42500）6g蒸馏水1200mlN 盐酸60ml偏重亚硫酸氢钠12g用600ml蒸馏水溶解6g碱性复红，煮沸几分钟，冷却到50加入60ml N盐酸，冷却到25加入12g偏重亚硫酸氢钠（高纯度化学试剂）。液体放于暗处24小时。24小时后加56g活性炭，摇动大约1分钟。通过粗过滤纸过滤，

20、液体应该清亮，如果液体有颜色重复加入活性炭。最后补充蒸馏水至液体到总量600ml，放入棕色瓶中冰箱内保存。Schiffs 试剂质量测试：量10毫升37%甲醛倒入透明小玻璃瓶中，加几滴Schiff 试剂测试，质量好的Schiff 试剂会立刻变成紫红色。质量不好的Schiff 试剂会延长反应，而且颜色畸形伸长会变深呈蓝-紫色。另外，用水测试，把Schiff 试剂直接滴入水中，立即出现洋红色说明试剂质量很好，出现粉红色或无色，说明质量不合格或过期，应该从新配制。Schiff 试剂保存：常规棕色瓶内贮存，冰箱内4保存。这种条件下保存的Schiff 试剂最长有效时间不超过1年。有些有效期更短，3个月，甚

21、至12个月。具有关资料介绍Schiff 试剂配制后进行分装冷冻保存可以延长试剂的有效时间。融化后使用，染色效果和新配制的Schiff 试剂比较没有区别。可以保存数年，本人使用过冷冻贮存4年以上的Schiffs试剂，并不影响染色结果。3. Mayers苏木精液PAS染色步骤1. 切片脱蜡至水。2. 0.5%过碘酸氧化5分钟。3. 蒸馏水冲洗。4. Schiffs 试剂染15分钟（切片变为粉红色）。5. 自来水冲洗5分钟。（切片变成深红色）。6. Mayers苏木精染1分钟。7. 自来水冲洗5分钟。8. 95%乙醇，100%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。结果：糖原，粘液和基底膜-红色/粉红色

22、.,背景-蓝色。PAS/D-糖原淀粉酶消化染色法简述：-淀粉酶是一种消化酶，唾液中含有淀粉酶。对照：相同的组织块上切两张切片。一张消化另一张不消化。然后两张切片都用PAS染色。肝脏是最好的对照组织。试剂配制：1. 消化液淀粉酶（用-淀粉酶）0.05g蒸馏水50ml首先Sigma产品-淀粉酶 VI-B 产品号A3176。用蒸馏水慢慢溶解酶。新鲜配制，15分钟内使用，用后丢弃。2. 0.5%过碘酸过碘酸2.5g蒸馏水500ml3. Schiffs试剂碱性复红（CI42500）6g蒸馏水1200mlN 盐酸60ml偏重亚硫酸氢钠12g用600ml蒸馏水溶解6g碱性复红，煮沸几分钟，冷却到50加入60

23、ml N盐酸，冷却到25加入12g偏重亚硫酸氢钠（高纯度化学试剂）。液体放于暗处24小时。24小时后加56g活性炭，摇动大约1分钟。通过粗过滤纸过滤，液体应该清亮，如果液体有颜色重复加入活性炭。最后补充蒸馏水至液体到总量600ml，放入棕色瓶中冰箱内保存。染色步骤1. 石蜡切片脱蜡至蒸馏水。2. 用微波炉加热淀粉酶液20秒。3. 放标记消化切片用加热的淀粉酶液消化15分钟，不要过度化消。4. 自来水冲洗，蒸馏水洗。5. 两种切片同时按PAS步骤染色。结果：未经淀粉酶消化的切片糖原被PAS染成洋红色，经淀粉酶消化的切片消失。说明：如果切片消化过度，组织需要重切。消化过度有花边现象，甚至没有组织留

24、下。Highmans刚果红染色法（Highman 1946）这是一种简便、广泛被应用的染色方法。染液的稳定性相当好。该方法经有经验的老手选择提供。资料来源组织学技术Theory and Practice of Histological Techniques (第六版)。固定：不关键；福尔马林盐能获得满意的结果。试剂配制：1. 0.5%刚果红溶液（0.5g刚果红溶解于50%乙醇100ml）。2. 0.2%氢氧化钾液（0.2g氢氧化钾溶解于80%乙醇100ml）。染色步骤1. 切片脱蜡至水，必要时祛除色素。2. 刚果红液染5分钟。3. 0.2%氢氧化钾液分化310秒。4. 水洗，明矾苏木精染核，分

25、化，返蓝。5. 脱水，透明，封固。结果：淀粉，弹力纤维，噬伊红颗粒-红色。 核-蓝色。说明：第3步分化，可以用水终止，分化过度可能会发生，如果必要可以重复。PTAH染色法（Shum&Hon 1969）A液苏木精0.8g蒸馏水1ml 0.8g苏木精加1ml蒸馏水研磨成糊状，（糊状液体应该呈巧克力颜色，颜色淡的通常是指示剂不适合此方法染色，应该丢弃）。B液磷钨酸0.9g蒸馏水9mlA液和B液混合，煮沸，冷却后过滤。染色步骤1. 切片脱蜡至水。2. 酸性高锰酸钾处理5分钟。3. 自来水冲洗。4. 5%草酸水溶液漂白。5. 充分自来水洗。6. 染PTAH液1224小时，室温。PTAH液56染几个小时，

26、结果更确切完全可以代替室温下染色。7. 蒸馏水洗。8. 迅速脱水，透明，封固。PTAH液自然氧化方法油红O脂质和脂肪染色用途：显示脂质和脂肪。固定：10%幅尔马林。冰冻切片：48微米。染色液配制10.5%油红O溶液油红O 0.5g100%异丙醇100ml加入少量的异丙醇溶解油红O并搅拌，逐渐加入剩余的异丙醇，加热溶液到95左右，不超过100，冷却到室温用滤纸过滤。或室温过夜，用特殊玻璃装置真空抽吸，配制的溶液在室温中可保存数年。如果液体表面有膜形成可以用一张薄纸片除去。285%异丙醇溶液异丙醇（100%）85ml蒸馏水15ml3Gills苏木精染色步骤1 空气中干燥切片30min，用10%福尔

27、马林固定5min。2 蒸馏水洗3次。3 100%异丙醇5min，防止切片上的水带入油红O染液中）4 油红O液60染色8分钟。5 85%异丙醇溶液洗5分钟。6 蒸馏水洗3min。7 Gills苏木精染色30秒。8 流水冲洗3min。9 蒸馏水洗2次。10 甘油明胶封片。结果：脂肪红色，细胞核淡蓝色。改良油红O-糊精染脂肪色法（Churukian 2000）固定：新鲜冰冻组织中性缓冲福尔马林。切片：冰冻切片5微米，SuperFrost 载玻片贴片，空气中晾干切片。试剂配制：油红O液油红O0.5g纯异丙醇100ml混合后过夜糊精水溶液糊精1g蒸馏水100ml工作液储备液油红O液60ml糊精水溶液40

28、ml或油红O液油红O0.9g纯异丙醇180ml搅拌过夜糊精水溶液糊精 1.2g蒸馏水 120ml工作液油红O液180ml糊精水溶液120ml放置1天或更长时间，液体可稳定数月。使用前过滤。染色步骤1. 切片直接放入过滤的油红O-糊精液中染色20分钟。2. 流水稍冲洗。3. 对比染色用Gill 苏木精染20-30分钟。4. 流水冲洗返蓝。5. 水溶性封固剂封固。结果：脂肪灿烂红色核蓝色。* Dextrin, bacteriological grade or Type Sigma, from com. Dextrin is hydrolyzed com starch. VWR(VWR Scient

29、ific) also has small quantities; must be most soluble form of dextrit劳克监牢蓝法劳克监牢蓝属于铜-钛菁染料（copper-phthalocyanine dye），在酒精溶液中具有与髓鞘磷脂结合的染色特性，再经过中性红或焦油紫复染还能染出神经元的胞核及尼氏小体，而且对髓鞘着色反应具有强化作用。固定：10%福尔马林生理盐水或福尔马林-钙液。切片：石蜡切片15-20微米，火棉胶或冰冻切片均可。试剂配制：1. 劳克监牢蓝液劳克监牢蓝MBS 0.1g10%醋酸液0.5ml95%酒精100ml染液配制后过滤使用，可以长期保存。2. 0.

30、5%中性红水溶液染色步骤1 切片脱蜡入无水酒精。冰冻切片直接入无水酒精。2 放入染液中染色816小时，60，染色缸需要密封。3 经70%酒精，然后蒸馏水洗。4 0.05%碳酸锂水溶液分色，石蜡切片1030秒，厚冰冻切片10分钟。5 再经70%酒精继续分色两次，每次3060秒。至灰、白质区分清晰。如果还不清晰可继续分色。6 蒸馏水洗。7 0.5%中性红水溶液加数滴冰醋酸复染10min（1030min，视镜检、分色而定）。8 70%酒精进行复染分色，至细胞核及尼氏小体呈红色。9 正丁醇脱水两次，35min/次，二甲苯透明，中性树胶封固。结果：髓鞘蓝色，细胞核及尼氏小体红色。注：复染还可应用PAS，

31、Mallory磷钨酸-苏木精法显示神经胶质，Holmes度银显示轴索，油红O显示溃变退化的髓鞘。改良Glees和Marsland染色法试剂：1 20%硝酸银水溶液：2 Glees溶液：20%硝酸银30ml，无水酒精20ml，氨水。将酒精加入硝酸银液中，立即出现乳白色沉淀再逐滴加入氨水直到沉淀溶解为止。最后再滴加4滴氨水，过滤后使用。3 5%硫代硫酸钠水溶液：硫代硫酸钠5g，加蒸馏水至100ml。染色步骤1 石蜡切片脱蜡至蒸馏水。2 预热3720%硝酸银水溶液浸染30mins（切片为淡黄色）。3 不洗，直接入10%福尔马林液直到液体变清为止。4 快速过Glees溶液后，再放入Glees溶液30秒

32、1 min。5 取出切片，用滤纸吸干组织周围多余Glees溶液。6 不洗，直接放入10%福尔马林液还原23mins，更换23次10%福尔马林液。7 自来水洗，然后换蒸馏水洗。8 5%硫代硫酸钠水溶液固定切片5mins。9 充分自来水洗。10 95%酒精，无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。结果：神经元轴突及神经纤维-黑色，背景-黄色。第5步应镜下控制，如浸度不够深可再重复第4步一次。所用玻璃器皿，玻片应化学纯净，这样可减少非特异性着色及氨银夜污染。碱性磷酸酶染色法Gomori钙法（Gomori 1951，改良）固定：福尔马林钙4。切片：冰冻切片，后固定。试剂配制：孵育媒介液配制2%甘油磷酸

33、钠2.5ml2%巴比妥钠2.5ml2%硝酸钙5ml1%氯化镁0.25ml蒸馏水1.25ml孵育媒染液的最终pH 9.09.4。巴比妥钠起着媒介缓冲作用而镁离子作为酶的激活剂。染色步骤1. 适当固定后切片至水。切片放入孵育媒介液37孵育25分钟到6小时。2. 充分蒸馏水洗。3. 重复洗。4. 切片用2%硝酸钴处理3分钟。5. 充分蒸馏水洗。6. 重复洗。7. 切片浸入1%硫化铵2分钟。8. 充分蒸馏水洗。9. 甲基绿（氯仿提取）对比染色。10. 充分自来水洗。11. 甘油-明胶封固。结果：活跃的碱性磷酸酶棕黑色核绿色说明：a. 为了方便保存贮存液 按20ml批次配制。b. 孵育时间各异根据制备的

34、类型，冰冻切片需要的时间最短。琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase,SDH）染色1. 在下面液体内37孵化30min。1）0.2mo/L琥珀酸钠15ml2）0.2mo/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）15mlNBT 30mg调整pH至7.2-7.62. 依次入30%60%90%6030%丙酮（时间延长会褪色，操作要迅速。30%可省略）3. 水洗4. 甘油明胶封片作为氧化酶的SDH与NADH-TR同样存在着局限性。NBT被还原后产生甲腊（formazan）颗粒沉淀。染色结果也接近于NADH-TR，但颜色较淡，肌纤维类型也较难分别。但与NADH-TR相比，线粒体特异性较强，对线

35、粒体脑肌病的诊断很有帮助。乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）染色1. 下面液体内37孵化30min。乳酸钠 1.5mlNBT30mgNAD12mg0.2 mol/LTris盐酸缓冲液（pH7.4）30ml调整pH至7.02. 依次入30%60%90%6030%丙酮，时间要短。3. 水洗4. 甘油明胶封片与NADH-TR和SDH相比，LDH染色性最差，肌纤维类型的区分也很困难。除特殊情况外，观察氧化酶反应NADH-TR以很充分，不影响疾病的诊断。ATP酶染色方法一试剂使用如下：1. 甘氨酸缓冲液甘氨酸7.5g 氯化钠5.8g蒸馏水1000ml2. 氯化钙缓冲液甘氨酸

36、缓冲液500ml1 M氯化钙 100ml0.1 M NaOH350ml（大约）用1 M NaOH调普pH 9.5 3. 醋酸缓冲液 pH 4.30.2 M 醋酸36.8ml0.2 M 醋酸钠13.2ml蒸馏水100ml4. ATP ( Disodium salt,Sigma chemicals Ltd ) 用于工作液 ATP5mg蒸馏水数滴用数滴蒸馏水溶解ATP5. 二硫苏糖醇 1 mM ( 每月更换新液)6. 2% 氯化钴液7. 1% 硫化铵液（ 新鲜配制 ）8. 1% 氯化钙液9. 反应混合液 1滴二硫苏糖醇( DTT 1 mM )和 ATP工作液加到10ml氯化钙缓冲液中常规ATP酶法（

37、pH 9.4）按下列步骤执行1. 冰冻切片8微米贴到盖玻片上2. 反应混合液 1滴二硫苏糖醇( DTT 1 mM )和 ATP工作液加到10ml氯化钙缓冲液中立式染色缸中 37 30分钟3. 1% 氯化钙液充分洗23分钟4. 2% 氯化钴液 2次 每次1分钟5. 蒸馏水彻底冲洗4次6. 1% 硫化铵液（ 新鲜配制 ）30秒（ 此步骤在通风橱内进行 ）7. 颜色显影后用蒸馏水冲洗，甘油明胶封固ATP转换酶染色法如下1. 切片放入pH 4.3或pH 4.6醋酸缓冲液37 10分钟2. 迅速用1:4V/V稀释氯化钙缓冲液洗3. 常规ATP酶反应液处理，但用1:4V/V蒸馏水稀释氯化钙缓冲液洗之前另外

38、加ATP和二硫苏糖醇( DTT 1 mM )我们发现新鲜冰冻切片染色结果好，冷冻后放置几天的冰冻切片也能成功的染出结果。ATPase染色方法二本方法是区别肌纤维类型最好的染色方法，要稳定染色方法需要下一番功夫。区别和型肌肉纤维比较难的原因在于前处理液的pH值准确性问题。技术书明确给的前处理液的pH值9.4，但肌病下的pH值10.0.虽然能够区别肌纤维类型，但有时候颜色较淡，或者有斑点，原因多半是硫化氨质量问题造成的结果。注意选用高质量的化学试剂，开封后按说明妥善保存。染好的切片放一段时间发现切片组织上的染色褪色，放置几个月后染色甚至会消失，这种现象多半是组织脱水不净或水溶性封片剂质量不好造成的

39、原因。对于ATPase染色的保存传统的封片剂加拿大树胶最好。ResultsPRE-INC pH TYPE 1 TYPE 2A TYPE 2B TYPE 2C9.4 light (0 +1) dark ( +3) dark (+3) dark (+3)4.6 dark ( +3) light ( 0 ) intermediate (+1 +2) intermediate (+1 +2)4.3 dark ( +3) light ( 0 ) light ( 0 ) intermediate (+1 +2)酸性磷酸酶（Acid phosphatase）染色1. 在冷却到4的下述液体中固定10min。巴

40、比妥醋酸盐缓冲液（pH5.0）12ml丙酮 18ml2. 水洗3. 下述液体中37孵育60min。4%亚硫酸钠0.6ml副品红液0.6ml将两种液体混合，室温放置一段时间加入19.5ml蒸馏水。Naphtol AS-B 1 phosphate15mgN,N-dimethyl formamide1.5ml每次分别配制这两种液体，然后混合，临用时加入巴比妥醋酸盐缓冲液7.5ml最后pH值调整为4.75.0（用2N NaOH调Ph）4. 水洗5. 0.3%甲基绿30秒（对核对比染色）6. 水洗7. 甘油明胶封片副品红液 2N-HCl 50ml，加入盐酸副品红2g，轻微加热溶解，室温冷却，过滤保存。巴比妥醋酸盐缓冲液（pH5.0）醋酸盐0.97g巴比妥钠1.47g蒸馏水140ml0.1N HCl90ml（大约）酸性磷酸酯酶染色在巨噬细胞（溶酶体内大量存在）和包体内有自噬反应时呈阳性。乙酰胆碱酯酶（