实验一底物浓度对酶促反应的影响[参照模板]

1、实验一 底物浓度对酶促反应的影响、实验目的掌握底物浓度对酶活性的影响，了解碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AKP )的Km值的测定原理和方法，理解Km值的意义。、实验原理在温度、pH及酶浓度等恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。当底 物浓度较低时，酶促反应速度V随底物浓度S的增高而显著加快，随着底物浓度渐高，反应速度加快程度渐小，当底物浓度增加到一定程度以上时，再增高底物浓度，反应速度亦 不再增加，成为该条件下极限最大反应速度Vmax。底物浓度与反应速度的这种关系可以用下列米曼(Michaclis-Menten )氏方程式表示。v= V max S Km

2、S式中，Km为米氏常数。当 V=Vmax/2时，贝U Km=S，即米氏常数是反应速度等于最 大速度一半时底物物浓度的数值。如图所示：Km是酶的特征性常数，不同酶的Km值不同，同一酶作用于不同底物的Km值亦不同。大多数纯酶的 Km值在0.01100mmol/L之间。Km值的测定在酶学研究中有重要的 实际意义。根据实验结果绘制上述直角双曲线，难以准确求出Km和Vmax值。而用米曼氏方程式的下列变换式，则容易求得Km及Vmax值。-仅供参考一一页眉页脚可删除米曼氏方程式中各项皆采用倒数表示，则成为Lineweaver Burk氏方程式:Km 11= + V V max S V max如图所示:SKm

3、Lineweaver Burk氏法作图求 Km值这是个上截式直线方程式。1截距为，横轴截距为-V max系作图而容易正确得出 Km值。1 1与一为直线关系，如上图。直线斜率为V S1据此可以测定不同浓度底物的反应速度，按Km龟，纵轴V max1 1-与丄关V另有其他变换式，例如把上式两侧皆乘以S，则转换成 Wilkinson氏方程式。宜=耳+亠伺V V max V max如图所示:图3 Wilkinson氏法作图求 Km值这也是直线方程式。以S为纵轴，S为横轴作图，则直线在横轴上的截距为Km.V本实验利用磷酸苯二钠法测定不同浓度底物的碱性磷酸酶（Alkali ne Phosphatase,AK

4、P ）的反应速度，作图求出Km值。AKP的催化原理为：在一定 pH和温度下，待测液中的 AKP作用于基质液中的磷酸苯 二钠，使之水解释放出酚。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林（AAP）作用并经铁氰化钾氧化，生成红色醌类化合物。以酚作标准液同样处理显色进行比色，可测知酚的生成量，从 而计算出酶的活力。C.HSK3Fc(CN)bcnh34氨基安替比林CsH5IN/ HiCN C =0HQYCNHg3= 0醍衍生物三、实验器材试管、37C水浴锅、可见分光光度计、座标纸四、实验试剂1、0.04mol/L 基质液称取磷酸苯二钠2H2O 10.16g，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并稀释至1000mL。加4mL氯

5、仿防腐贮于棕色瓶中冰箱保存，可用一周。2、 0.1mol/L pH10碳酸盐缓冲液（含 0.3% 4-氨基安替比林）称取4-氨基安替比林（AAP）3g,用0.1mol/L pH10碳酸盐缓冲液溶解并稀释至 1000mL，放棕色瓶内，冰箱保存。3、酚标准液（1mg/mL ）与酚标准应用液（0.1mg/mL） 酚标准液（1mg/mL ）:称取结晶酚1.0克溶于0.1N盐酸至1000mL。 酚标准应用液（0.1mg/mL）:准确吸取酚标准贮存液（ 1mg/1mL） 10.0 mL于100mL 容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，贮存冰箱中可保存一个月。4、0.5%铁氰化钾溶液称取5g铁氰化钾和15g硼酸，

6、分别溶于400mL蒸馏水中，溶解后两液混合，再加蒸 馏水至1000mL，置于棕色瓶中暗处保存。5、O.1mol/L pH10碳酸盐缓冲液（37 C时）称取无水碳酸钠 6.36g及碳酸氢钠3.36g溶解于蒸馏水中，稀释至 1000mL。6、0.01mol/L pH8.8 Tris 缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，用蒸馏水溶解并稀释到1000mL，此即为0.1mol/LTris溶液。取上液100mL，加蒸馏水约 700mL，再加0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后用 1 %醋酸调pH到8.8，用蒸馏水稀释至 1000mL。7、酶液AKP （10mg , 10U/mg ）用0.

7、01mol/L Tris缓冲液稀释成每 mL含0.71.0单位的酶溶 液。实验操作取干净试管8支，编号，按下表操作。特别注意准确吸取酶液、基质液及标准液。管号123456SB0.04mol/L 基质液（mL)0.100.200.300.400.801.00水（mL）1.401.301.201.100.700.501.501.50碳酸盐缓冲液（含（mL）AAP)1.501.501.501.501.501.501.501.50摇匀37 C，保温5min0.1mg/mL酚标准液（mL） 0.10 酶液（mL）0.100.10 0.100.100.100.100.10充分摇匀，37 C准确保温15mi n0.5%铁氰化钾（mL）2.002.00 2.002.002.02.002.002.00混匀，室温放置 10min以B管调零，读记在510nm处的各管光密度值 OD，并填入下表，计算有关数据并作 图。如按林贝氏法可如下进行：列表并计算记入各有关数据。底物浓度对酶促反应的影响AvV 口吕号t1t2t3t4t5t6S光密度ODV1/VS1/S（1）计算出各管的酶活性单位 ODt/ODsX0.01,此数代表反应速度（V）。计算出各管底物浓度：基质液浓度叮反应总液量=04迦