实验一细胞培养室的设置和无菌操作

1、实验 1 细胞培养室的设置和无菌操作【实验原理】细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的 影响。一般标准的细胞培养室应包括配液室、准备室和培养室。三室既相互连接又相对独立，各自完成培养 过程中的不同操作。【实验目的】 了解培养室的设置和设备。 学习无菌概念和无菌操作要领。【操作步骤】1实验室设置（1）配液室（2）准备室（3）培养室培养室内要完全密闭，保持恒定的温度，在设计上要注意以下几点： 培养室的位置最好设在阴面，阳光不能直接照射的地方，防止室内温度增高。 天花板的高度不要超过 2 米，以保证紫外灯的有效杀菌效应， 门一般用拉门，以防止空气流

2、动。 天花板、地板和四周墙壁要光滑无死角，要镶瓷砖或涂油漆，这样设计，一是便于清洗和消毒，另外也不易在墙角堆积灰尘。2实验室常用设备（ 1）准备室的设备 双蒸馏水蒸馏器：制备双蒸水。 酸缸：盛洗液，浸泡玻璃器具。 烤箱：洗涤完的玻璃器皿用烤箱烘干。 高压锅：玻璃器皿、解剖用具、部分液体、塑料器具等灭菌。不同物品其有效灭菌压力和时间不同。 储品柜 1：放置未消毒物品。 储品柜 2：放置已消毒物品。 包装台：灭菌前的包装用。准备室注意事项： 预防蒸馏器被烤干。 放置水池中的水渗出。 勿将酸液溅到衣物或地面。 勿将高压锅排气阀和安全阀堵塞。 已消毒物品应与未消毒物品分柜存放。（2）配液室的设备 天平

3、（扭力天平和电子天平）：称量用 pH计： 磁力搅拌器：（ 3）细胞培养室的设备 超净工作台：超净工作台的种类很多，有单面单人、单面双人、双面双人或双面四人等，其工作原理是利用鼓风机， 使通过高效滤气的空气，徐徐通过台面，这样使工作环境中具无菌而均匀的空气。根据层流方式的不同，超净工作台主要分为水平层流式和垂直层流式两种，基本原理大致相同，都是将 室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器，由此送出的洁净气流从一定的均 匀的断面风速通过无菌，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。但两种净化台的气流方向不同。較処机構二煙址扳 i亀明灯无葡气海x蚱贯式气Mt板殊机nV腑前护板B疽

4、海式使用超净工作台应注意的几点问题：A 净化工作台最好安装在无尘的房间内，最好为隔离好的无菌间内，以免尘土过多易使滤器阻塞，降 低净化效果，缩短使用寿命。B. 新安装的或长期未使用的工用台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工 具进行清洁工作，再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。C. 每次使用工作台时，应先用75%酒精擦洗台面，并提前以3050min 紫外线灭菌灯处理净化工作区内积累的微生物。在关闭紫外灯后应启动送风机使之运转两分钟后再进行培养操作。D 净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流型不受干扰。E. 般情况下，高效过滤器三年更换一次。更换高效滤器应

5、请专业人员操作，以保持密封良好。要定期将粗过滤器中的过布（无纺布）拆下清洗，时间应根据环境洁净程度而定，通常间隔36个月进行一次。F. 每次使用净化台要及时清除工作台面上的物品，并用洒精擦洗台面使之始终保持洁净。 4 C冰箱和低温冰箱： CO2培养箱：A .一定浓度的 CO2对细胞生长，尤其是原代培养和单细胞培养有促进作用（5% ）。B. 一定浓度的 CO2可维持培养液恒定的 pH。适用于开放培养，培养箱封口后，可在一般恒温培养箱内培养，但是采用培养皿或多孔板培养时，则需要高湿度和高CO2 含量的空气。C.它增加了湿度，箱体内装有水浴，可以保证培养箱内的湿度。D 培养箱内装有紫外灯。E. 通过

6、气体流量计可以调节 CO2和空气的比例。F. 在水中可加入防腐剂（二氧乙酸）。可防止因CO2培养箱中湿度较高，易长霉菌。 臭氧发生器： 离心机： CO2钢瓶： 液氮罐： 储品柜：用来存放杂物 紫外灯： 空气净化系统 倒置显微镜3 .无菌操作（ 1）无菌室的灭菌： 紫外灯无人时就要打开； 进无菌室要穿无菌服、戴帽子和口罩； 每周清洗消毒一次； 所用物品要以外科手术方式严格消毒； 室内台面要要保持洁净，做完实验后，用 75酒精或千分之三新洁尔灭棉球擦拭超净工作台的台内、边台的台面、倒置显微镜的载物台等； 所用物品要一次性准备好； 瓶口要用酒精火焰消毒； 尽量减少出入。（ 2）实验人员的无菌准备：肥皂洗手穿好隔离衣 酒精棉球擦手实验报告】画出一个标准细胞培养室的草图，标明各室的必须设备。思考题】1 观看演示