双酶切连接反应

1、原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了 很多次，不过很快改善了 实验方法，用 2 周重组了 14 个质粒。现就自己的体会， 结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。1、 回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,Hindlll提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER以及各酶在公用BUFFER!的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：双酶切时间及其体系： 需要强调的是很多人建议酶切过夜，其

2、实完全没有必要，我一般酶切 3个小时，其实 1个小时已经足够。 应用大体系，如 100 微升。纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在 50反应液中，30C温度下反应1小时，将1 勺X DNA完 全分解的酶量定义为1个活性单位（U）。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解15gg的DNA

3、，而 一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3gg,而PCR纯化后的产物（50体系）约为3g&所以即便全部加进去，只要纯化的 质量 好，酶切完全切得动。2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的 PCR产物片段=1:10 ，一般取前者，后者取。pmol为单位的 DNA转换为为 eg单位的DNA：（ X pmoles长度bpx 650 / 1,000,000 （注：长度 bpx 65（是该双链 DNA的分子量）所得数值即为 eg也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=e潮载体是5380bp

4、,则为xxe=g。测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约另外，如果嫌麻烦，也可用 MARKER进行估测，女口 MARKER2000 5微升的 MARKER每个条带约 50ng。连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 e的连接反应体系中，6eg勺XDNAHindIll的分解物在16C下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为3 个小时足已350 U/ e，l 所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3、转化: a、 全量（10 QI加入至100 |i I JM10感受

5、态细胞中，冰中放置 30分钟。b、42C加热45秒钟后，再在冰中放置 1分钟。c、 加入890 q I AM阴性培养基，37C振荡培养60分钟。取100 Q铺板。也可离心后余100 Q几个非常重要的问题1做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时,16度.2对含有AMP-RESISTENC的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干3对照的设立：为验证双酶切是否成功，可做如下对照：A

6、酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER跑胶看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时，也要进行对照.设4个：A. 即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应，这个对照可进一步看双酶切是否成功，如果长出克隆，说明很有可能只进行了单酶切，如 没长出克隆，则证明双酶切成功，当然要保证感受态，培基，连接酶都正常的情况下.B. 酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化，这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒C. 设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误.阴性板上用同一批感受态细胞铺板 20微升足够，检测感受态状况.4. 所有的试剂切记低温保存.一步一

7、个脚印.不要偷懒，图省事最后却更费事.注意设立对照。经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的挑克隆中，我只挑选 4个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。希望大家不断补充。Ding 下，和我的方法差不多。springwel wrote:用2周重组了 14个质粒。这个效率非常不错！佩服！ smartkev in wrote:Ding 一下，和我的方法差不多。连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min，马上置于冰上冷却，再加入buffer和ligas这个操作是什么原理为什么要选择45C其实也不一定45度，估计50度也行，45度对于几个碱基结合（酶切位点）的打开绰绰有余

8、。分子克隆3的经典操作，个人认为主要目的如下：插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处理是其粘性末端打开。由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。spr in gwel wrote:酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在 50反应液中，30C温度下反应1小时，将1 g的X DNA完全分解的酶量定义为1个活性单位（U）。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解15gg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3gg,而PCR纯化

9、后的产物（50体系）约为3g&所以即便全部加进去，只要纯化的质量 好，酶切完全切得动。color=red但是公司给推荐的一般都是 2。Oul体系加1ul，其实我有的时候为了省酶，在20ul只加酶，切的也很好。我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamda DNA 样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才 10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。smartkevin wrote:其实也不一定45度，估计50度也行，45度对于几个碱基结合（酶切位点）的打开绰绰有余。分子克隆3的经典操作，个人认为主要目的如下：插入

10、片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处理是其粘性末端打开。由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。如果真的是这样我觉得对于非同源粘性末端和平末端作用不大，对于同源粘性末端可能有作用。不知道还有没有其他的解释我倒是没有仔细看过分子克隆。mybbff wrote:如果真的是这样我觉得对于非同源粘性末端和平末端作用不大，对于同源粘性末端可能有作用。不知道还有没有其他的解释我倒是没有仔细看过分子克隆。刚才查了一下分子克隆3,只说了一句 以消除重新复性而导致的末端相互聚合”（中文版p71

11、）。其实如果是粘性末端酶切的话都是有用的，无所谓非同源和同源末端，就算是非同源末端，载体和载体，片段和片段也能聚合。对于平末端应该就没有什么作用了autumnsun wrote:但是公司给推荐的一般都是 2。Oul体系加1ul，其实我有的时候为了省酶，在20ul只加酶，切的也很好。我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象lamda DNA 样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。如果100ul里的DNA太多了也不行啊，酶和 DNA还是要匹配的我不明白的是，我们一般的质粒载体

12、是否象lamda DNA 一样好切，如果是那样的话，100ul体系加1ul可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才 10ul，按推荐量加，做两个100ul体系需要两管，不知道有人试过没有。其实除了考虑酶浓度（每微升多少个单位）以外，还应该考虑这种酶在lamda DNA上的酶切位点数目。比如用 Hincll和Xbal双切pUC118,这两个酶在 叫C118上都只有一个酶切位点，而在 lamda DNA上的酶切位点分别是 35个和1个。根据酶活性的 定义，相同单位的Hincll和XbaI对pUC118的酶切效率是35比1，所以在双酶切体系中，所用的 Hincll显然应该要少很多。好！ ！真实

13、用！ ！回收的载体片段：回收的 PCR产物片段=1: 10，般取前者，后者取是不是应该前者，后者啊精华！投你一票!msher wrote:好！ ！真实用！ ！是不是应该前者，后者啊已经改了 ,谢谢 !昨天 14 个测序结果出来，全部是阳性克隆。两边是载体的序列，中间是插入的目的片段。回顾自己的实验现补充几点。做转化时 ,也要进行对照 .设4个:A. 即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应，这个对照可进一步看双酶切是否成功，如果长出克隆，说明很有可能只进行了单酶切，如 没长出克隆 ,则证明双酶切成功 ,当然要保证感受态 ,培基,连接酶都正常的情况下 .B. 酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转

14、化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒C. 设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误.阴性板上用同一批感受态细胞铺板 20 微升足够 ,检测感受态状况 .就上面的对照简要说一下我的结果。 转化后第二天可见 14个标本的平皿上长了很多克隆，约 100个左右，我用的是直径 6cm 的板子，所以仍显较多，（我是先挑半个克隆并标记好行PCR鉴定后再对另外的一半进行摇菌抽提质粒），较难挑克隆，所以铺皿时不用离心， 直接用 100微升的铺皿就可以了 ，我其中一个是这样做的，长得克隆较大，很好挑选。 下面简要的说一下对照的结果。A 只长出了 3个克隆，以 100的基数计算，约为 3%。

15、即双酶切反应中质粒只有 3%进行了单酶切B 约有 5 个克隆，即质粒完全没被切动的约 5%C 长了很多克隆，证明操作系统没有问题。为系统控制指标。D 长了很多克隆，证明感受态没有问题。这些对照相辅相成，扬长避短。万一什么都没作出来，也好分析原因。JM108 感受态细胞的制备面谈谈我制作感受态的体会。前期工作分子生物耗费时间在于准备过程太多。所以做好前期工作非常重要，所谓 磨刀不误砍材功 。注意事项1. 不要用经过多次转接或储于4C的培养菌，最好从70C或-20C甘油保存的菌种划板（AMP阴性）37度过夜培养，划板时用小TIP头挑少许冰渣即可，轻划 S行。同时记得设立对照：A、在AMP阳性板划菌

16、，排出 AMP抗性菌污染。大家都知道，实验室很多材料从师姐传师妹，或许经过很多人的转手。所以从头鉴定所用材料的可靠性非常必要。B、 AMP 阴性空白培基。系统控制参照，为更准确起见，用TIP头不沾任何东西进行划板。第二天挑克隆。2. 质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态 DNA（cccDNA）。转化效率与外源 DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50的感受态细胞达到饱和。一般 情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。不过我一般链接反应后（TAKARA的链接酶，体系25微升）会全量加

17、到200微升的感受态里，约为150ng （载体微克，目的片段约微克）。效果也好。3. 试剂的质量：所用的试剂，如 CaCI2等均需是最高纯度的（GR或AR.）,并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。国产的 当然也可以。我用都是国产的，好像是陇西化学制剂，分析纯。4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行 ,所用器皿，如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处 理,所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、 DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂 DNA的转入,为以后的 筛选、鉴定带来不必要的麻烦。培养基的配制1.配制LB-AMP抗性培养基LB液体培养

18、基：精解蛋白胨 10g，酵母抽提物5g,氯化钠I0g,加去离子水800ml充分搅拌溶解， 用1mol/LNaOH调，补加去离子水至1000毫升，高压灭菌，4度保存。我一般没有用1mol/LNaOH调。而是直接精解蛋白胨10g， 酵母抽提物 5g， 氯化钠 l0g 加去离子水至 1000ml。固体培养基：LB液体培养基中加琼脂粉，高压灭菌消毒；母液：用无菌水或生理盐水配制成 100mg/ml即100 ug/ul溶液置-20C保存；AMP500mg/支，一支用5ml稀释即得。然后分5 支分装 （浓度 100mg/ml 即 100 ug/ul）4.含Amp的LB固体培养基：将配好的LB液体培养基高压

19、灭菌后冷却至 60C左右加入Amp储存液，使终浓度为100ug/ml摇匀 后铺板（30ml/90mm ）:即多少毫升培养基加多少微升上述的Amp母液多少毫升培基=加多少微升母液，或减半量则最终浓度为 50ug/ml有指南上写细菌转化后 37度复苏时用SOC培基。我从来只用AMP阴性的普通培基，效果也很好。CaCI2溶液:我们实验室只有 CaCI2-6H2O,分子量219，配制100ml的，则需称量X 219就可以了。其实氯化钙的摩尔浓度在均 可。溶于50ml重蒸水中，定容至100ml,高压灭菌。6.含15%甘油的L CaCl2:先配制成L的氯化钙溶液50ml，加入15ml甘油,定容至100ml

20、,高压灭菌。有文献说要用的滤器，其实 完全没有必要。高压即可。一、受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的JM109单菌落，接种于3-10ml LB液体培养基中，37C下振荡培养12小时左右（一 般过夜）。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于10ml试管（如较多制备，多用几个试管即可）的 LB液体（AMP阴性）培养 基中同时做空的培基对照,37C振荡培养2-3小时至OD600 =左右。二、感受态细胞的制备 （CaCl2法）1、 将培养液分转入的离心管中（一管 10ml菌液可分装成约6管的离心管中），冰上放置10分钟,然后于4 C下3000g离心10分 钟。2、弃去上清，用预冷的L的CaC

21、l2溶液200微升轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟后4C下3000g离心10分钟。3、 弃去上清，加入200微升预冷含15%甘油的L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。4、贮存于-70C可保存半年。要点：1.悬浮细胞时动作一定要轻柔；2冰上。掌握者两点可谓掌握了制备感受态的精髓，无往不利。连接双酶切PCR鉴定目的片段是否连接上表达载体可能的原因，1.表达载体双切不充分，载体量太大，而酶又加的太少，酶切时间短2. 连接最好是1216小时，因为你的目的片段和载体的浓度比，不是很合适 3回收胶的问题 今天酶切时没有和空载体对比，TE,含有EDTA，会抑制连接酶的活性洗下

22、来后要先确定一下浓度，浓度太低可定连不上1:在使用 Wash Buffer洗涤前，在柱子中加入少量（200ul）溶胶液。室温 3-5分钟后，离心。再接标准洗涤及以后操作。该操作针对胶块大的情况。2：加入 Wash Buffer后，静置1-3分钟后，再离心。3：增加 Wash Buffer的洗涤次数 （少量多次）。胶的残留导致的问题不是单纯的胶残留问题，同时也会导致溶胶液中盐的残留-这似乎对连接影响更大。最好的解决方法是1;当然，可能会导致得率的小量下降，但质量绝对好。为了充分去除残留，总结，1多加一步200ul溶胶液，2.加 Wash Buffer前空柱离心 30 sec, Buffer洗涤

23、时静置及多次柱子允许胶通过的量是有限的，胶越多或是浓度太大，残留就会更明显，所以切胶时应该尽量要小，假如过大的话分到两个柱子里应该比较好，另外就是溶胶液宁可多加也不能少加首先要保证待测质粒的纯度，除PCR外，可以对重组质粒做两个双酶切反应：I与Xh0 I双酶切;2.选一个插入片段中特异存在的切点酶和质粒 ECoRI下游到Xba1间的合适位点酶（插入片段中没有的），进行双切，结果可 以预测到.每个双切反应包括酶1单切，酶2单切,双切三个反应，别忘了以空载体做对照.试试看.如果没有得到 重组质粒只好再连接反应了 .酶是TAKARA的，方法就是按说明书上做的，酶各1微升buffer 2微升，质粒5微

24、升,20微升体系.遇到双酶切可是两个酶没有共用 buffer时两种办法：一是低盐 buffer的酶先切，然后乙醇沉淀回收，然后 高盐buffer的酶再切，乙醇沉淀或切胶回收。也可以低盐buffer的酶先切，作用时间（一般37C孵育1小时或更长时间） 充分后加高盐buffer的酶再切，然后乙醇沉淀或切胶回收。通过摸索可以积累经验。我 记得NEB推荐BamHI和HindHI是分步切。要将PCR片段连入表达载体中，选的是TaKaRa的BamH I和Hind III,请问这个双酶切是在 37度反应还是30 度，要酶切多长时间PCR片段比较难切吗，引物两端都各加了 3个保护碱基？参考见解：一般37度2小

25、时就行，在酶切时，由于你所选用的酶都是效率比较高的，酶切一个小时就已经 足够了。不过若不放心，过夜也没问题。buffer需要共用buffer（比如Y buffer）。PCR片段的酶切效率与引物两端所加保护碱基有很大关系。如果保护碱基加的恰当，酶切应该不成问题。PCR产物，由于浓度较低，并不难切，只是在连接转化时难以成功。BamH I 一般加CGGGATCCC（的酶切效率高达90%。其它酶的具体情况可以查 NEW ENGLAND BioLabS勺目录。按 new england biolab的介绍，hindIII切割的时间较长，如果， 直接切per产物再连接有时效率不高，导致转化效率低。如果有条

26、件的话，可以先做at克隆，再酶切。TaKaRa 的产品目录的A部分里有关于双酶切所用 buffer的详细说明，最好依照执行。怎么才能鉴定质粒有没有被双酶切？参考见解：酶切后作个质粒自连实验，在感受态、连接酶等没问题的情况下，如果没有菌落长岀，说明双 酶切是成功的。当然，如果只长了很少的菌落，也是可以的。如果长了很多的菌落，那说明酶切不完全， 这时候就只有一个酶切位点切开了，质粒发生了自连。目的片断与载体应该是摩尔数之比为3 ： 16: 1可以在转化质粒时，以空质粒为对照这样来比较酶切目的基因及质粒载体后加Loading buffer终止反应，然后要直接进行连接反应，可以吗要是不行，还有一种方法

27、就是加热灭活限制酶（用的是Hind3/EcoR1双酶切），多高温度适合啊？参考见解：1、 一般直接用2倍体积的无水乙醇沉淀目的片段，干燥后直接用水溶解连接即可。比较适用于载体和PCR产物的连接。效果很好。2、 酶切后要胶回收后再连接，另外酶切结束后，直接电泳回收不用加终止液，对连接没有影响.3、 有的公司的限制酶（如 NEB）是不需要热灭活的，而有的公司的限制酶（如 MBI）则需要热灭活，一 帮是65摄氏度，10分钟。然后经凝胶回收后再作连接，目的片段与质粒的摩尔比在310: 1的范围内连 接效果都不错。4、通常随酶附送的loading buffer是含有SDS起到灭活的作用，但在上样时会产生

28、很多泡沫。1、 做双酶切的时候用的 buffer都是根据公司提供的双酶切最适buffer，每个公司应该都提供双酶切使用的buffer列表。2、酶切后电泳条带比较好，切胶回收的效果不好，可能是回收过程中操作出现问题，或者是回收试剂盒 有问题。可以尝试更换试剂盒做回收试试，或者看看酶切电泳后目的条带有没有弥散，如果有，切胶回收 得不到好的效果。3、用于连接的的片段应是单一的，如果将双酶切的质粒直接用于连接，即使得到了转化子，鉴定也比较 麻烦，自己都不知道连上的到底是目的片段还是非目的片断。最好用回收产物做连接。4、 酶切时如果质粒很大7kb那么希望得到的600bp亮度相对vector太暗了，可能看

29、不到，如果 600的带 看不到，可以试试加大酶切的质粒的量。相同mol数600和4900的带亮度差别会很大。5、 如果酶没有问题那就要确定双酶切是否已经切开了，已经切开了，只是600bp比较弱的话，可以尝试加大酶切体系（如增大酶切体系为原来的两倍或三倍），酶切后乙醇沉淀富集酶切片断后用小体积TE溶解后电泳，效果可能有所改善。如果根本就没有切开的话，那就要考虑是否是酶的问题，buffer的问题或质粒的问题。将载体和目的片段（PCR扩增产物，约500bp，两端设有酶切位点）分别用 EcoRI和BamHI双酶切后，定向 连接。但载体上该双酶切位点间有一个800bp的片段，酶切后电泳可见这一片段，表明

30、酶切成功，胶回收了大片段。连接转化成功后，挑选的单菌落提质粒，PCR鉴定表明有目的片段，约 500bp，但双酶切却仍然是800bp的原片段长度。目的片段不含有双酶切位点。请问连接是否成功若成功了，为何会出现这种奇 怪的现象？参考见解：如果pCR没有污染1、 假设挑选的是单菌落，则有可能是因为自己引物非特异扩增。PCR比酶切更易出问题，相信酶切结果， 没连上。2、假如PCR没有问题，最可能是菌被污染，连上了，但有污染。这种可能性大。假阳性产生的可能性极 大。3、最好重新挑科隆，摇菌。如果不行再用通用引物确定是否没有连上。4、应该使用载体引物来作 PCR鉴定，因为自己的引物作很有可能出现假阳性。5、 片断是500bp的，而载