分子生物学原理：DNA重组和重组DNA

1、目录目录目录目录 第十三章第十三章 目录目录 DNA克隆、测序与重组技术的历史 1973年，年，Stanley Cohen等人首次获得体外等人首次获得体外 重组重组DNA的分子克隆的分子克隆 1977年，年，Allan Maxam和和Walter Gilbert的的 化学裂解化学裂解DNA测序问世测序问世 不久，不久，Sanger 等的双脱氧测序法等的双脱氧测序法 2 0 世 纪世 纪 9 0 年 代 启 动 人 类 基 因 组 计 划年 代 启 动 人 类 基 因 组 计 划 （human genome project，HGP） 重组重组DNA技术学（技术学（Recombinant DNA

2、Technology） 目录目录 DNA重组(DNA reombination) 是指不同DNA分 子间通过断裂和连接产生片段的交换重新形成 新的DNA分子的过程。 无论是原核生物还是真核生物，细胞在增殖、 分裂、分化过程中经常发生基因重组或重排 (rearrangement)。 噬菌体或病毒感染宿主细胞时，外源DNA与宿 主DNA通常会发生重组或整合(integration）。 目录目录 第一节第一节 自然界自然界DNA重组的方式重组的方式 DNA Recombination in Nature 目录目录 DNA重组重组 接合作用接合作用 (conjugation) 转化作用转化作用 (tr

3、ansformation) 转导作用转导作用 (transduction) 转座重组转座重组 (transpositional recombination) 同源重组同源重组 (homologous recombination) 位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination) 目录目录 发生在同源序列间的重组称为发生在同源序列间的重组称为同源重组同源重组 (homologous recombination)，又称又称基本重基本重 组（组（general recombination）。是最基本的。是最基本的 DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，重组方式，

4、通过链的断裂和再连接， 在两个在两个DNA分子同源序列间进行单链或双分子同源序列间进行单链或双 链片段的交换。链片段的交换。 以以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机的同源重组为例，了解同源重组机 制的制的Holliday模型。模型。 一、同源重组一、同源重组 目录目录 nHolliday模型的4个关键步骤： 两个同源染色体两个同源染色体DNA排列整齐；排列整齐； 片段重组体片段重组体(patch recombinant) 拼接重组体拼接重组体(splice recombinant) 一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNA 对应的链连接，形成对应的链连接，形

5、成Holliday中间体；中间体； 通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNA； Holliday中间体切开并修复，形成两个双链中间体切开并修复，形成两个双链 重组体重组体DNA，分别为：，分别为： 目录目录 片段重组体片段重组体 ： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲 本本DNA。 拼接重组体拼接重组体： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双 链区的两侧来自不同亲本链区的两侧来自不同亲本DNA。 内切酶内切酶 (recBCD)

6、 DNA侵扰侵扰 (recA) 分支迁移分支迁移 (recA) 内切酶内切酶 (recBCD) DNA 连接酶连接酶 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holliday中间体中间体 5 3 5 3 5 3 5 3 Holliday中间体中间体 5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 3 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 内切酶内切酶 (ruvC) 内

7、切酶内切酶 (ruvC) DNA 连接酶连接酶 DNA 连接酶连接酶 拼接重组体拼接重组体 片断重组体片断重组体 目录目录 同源重组在建立转基因小鼠中的应用同源重组在建立转基因小鼠中的应用 目录目录 目录目录 二、位点特异性重组二、位点特异性重组 位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异序列的特异 位点间发生的整合。位点间发生的整合。 目录目录 噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染 色体的特异靶位点发生选择性整合；反转色体的特异靶位点发生选择性整合；反转 录病毒整

8、合酶可特异地识别、整合反转录录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录 病毒病毒cDNA的的长末端重复序列长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。 。 （一）（一）噬菌体噬菌体DNA的整合的整合 目录目录 attP attB attLattR 目录目录 （二）细菌的特异位点重组（二）细菌的特异位点重组 沙门菌沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。片段倒位决定鞭毛相转变。 目录目录 hix为反向重复序列，它们之间的为反向重复序列，它们之间的H片段片段 可在可在Hin控制下进行特异位点重组控制下进行特异位点重组(倒位倒位)。 H片段上有两个启动子片段上有两个启动子P，其一驱动，其

9、一驱动hin基基 因表达，另一正向时驱动因表达，另一正向时驱动H2和和rH1基因基因 表达，反向表达，反向(倒位倒位)时时H2和和rH1不表达。不表达。 rH1为为H1的阻遏蛋白基因。的阻遏蛋白基因。 目录目录 （三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排 免疫球蛋白免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链，由两条轻链(L链链)和两条重和两条重 链链(H链链)组成，分别由三个独立的基因族编码，组成，分别由三个独立的基因族编码， 其中两个编码轻链其中两个编码轻链( 和和 )，一个编码重链。，一个编码重链。 轻链的基因片段：轻链的基因片段： 重链的基因片段：重链的基因片段： L V J C L V

10、D J C 目录目录 重链重链(IgH)基因的基因的V-D-J重排和轻链重排和轻链(IgL)基基 因的因的V-J重排均发生在特异位点上。在重排均发生在特异位点上。在V片片 段的下游，段的下游，J片段的上游以及片段的上游以及D片段的两侧片段的两侧 均存在保守的重组信号序列均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基。此重排的重组酶基 因因rag (recombination activating gene)共有共有 两个，分别产生蛋白质两个，分别产生蛋白质RAG1和和RAG2。 CACAGTG(12/23)ACAAAAACC

11、GTGTCCAC TGTTTTTGG 重组信号序列重组信号序列基因片段基因片段 目录目录 免疫球蛋白基因免疫球蛋白基因V-D-J重排过程重排过程 目录目录 三、转座重组三、转座重组 由插入序列和转座子介导的基因移位或重由插入序列和转座子介导的基因移位或重 排称为排称为转座转座(transposition)。 大多数基因在基因组内的位置是固定的，大多数基因在基因组内的位置是固定的， 但有些基因可以从一个位置移动到另一位但有些基因可以从一个位置移动到另一位 置。这些可移动的置。这些可移动的DNA序列包括插入序序列包括插入序 列和转座子。列和转座子。 目录目录 插入序列插入序列(insertion

12、sequences, IS)组成：组成： IRTransposase GeneIR （一）插入序列转座（一）插入序列转座 二个分离的反向重复二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列序列 特有的正向重复序列特有的正向重复序列 一个转座酶（一个转座酶（transposase)编码基因编码基因 目录目录 插入序列发生转座的形式：插入序列发生转座的形式： 保守性转座保守性转座(conservative transposition) 复制性转座复制性转座(duplicative transposition) 非复制性转座非复制性转座(non-duplicative transp

13、osition) 目录目录 目录目录 转座子转座子(transposons) 可从一个染色体可从一个染色体 位点转移到另一位点的分散重复序列。位点转移到另一位点的分散重复序列。 IRIRTransposase Gene有用基有用基 因因 （二）转座子转座（二）转座子转座 转座子组成：转座子组成： 反向重复序列反向重复序列 转座酶编码基因转座酶编码基因 抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因 目录目录 细菌的可细菌的可 移动性元件移动性元件 A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示箭头所示) B转座子转座子Tn3：含有转座

14、酶、：含有转座酶、-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因 C转座子转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10 目录目录 利用转座将质粒利用转座将质粒A中的氨苄西林抗性基因中的氨苄西林抗性基因 转移到质粒转移到质粒B中中 目录目录 PB转座子转座子 -世界上首个高效实用的哺世界上首个高效实用的哺 乳动物乳动物TEs系统系统 目录目录 近些年常见的基因编辑技术近些年常见的基因编辑技术 锌指核酸酶（锌指核酸酶（ZFNs） 包含由多个锌指蛋白串联组成的包含由多个锌指蛋白串联组成的DNA识别识别 域和一个非特异性核酸内切酶域和一个非

15、特异性核酸内切酶 转录激活因子样效应物核酸酶（转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs） 包含植物病原菌黄单胞菌包含植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)自自 然分泌的蛋白然分泌的蛋白-TAL effector，以及，以及TAL效应核效应核 酸酶酸酶 目录目录 近些年常见的基因编辑技术近些年常见的基因编辑技术 CRISPR/Cas9 规律成簇间隔短回文重复序列规律成簇间隔短回文重复序列 细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的 获得性免疫防御机制获得性免疫防御机制 目录目录 四、原核细胞的多种基因转移方式四、原核细胞的多种基因转移方式 （一）接合作用（

16、一）接合作用 当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互 接触时，质粒接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转从一个细胞（细菌）转 移至另一细胞（细菌）的移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为转移称为接接 合作用合作用(conjugation)。 目录目录 可接合质粒如可接合质粒如 F 因子因子(F factor) 细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。分子。 质粒质粒 目录目录 （二）转化作用（二）转化作用 通过自动获取或人为地供给外通过自动获取或人为地供给外 源源DNA，使细胞或培养的受体细胞，使细胞或培养的受体细胞 获得新的遗传表型，称为获得新

17、的遗传表型，称为转化作用转化作用 (transformation)。 目录目录 例：例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。 目录目录 （三）转导作用（三）转导作用 当病毒从被感染的（供体）细胞释放当病毒从被感染的（供体）细胞释放 出来、再次感染另一（受体）细胞时，发出来、再次感染另一（受体）细胞时，发 生在供体细胞与受体细胞之间的生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移转移 及基因重组即为及基因重组即为转导作用转导作用(transduction)。 包 括 普 遍 性 转 导包 括 普 遍 性 转 导 ( g e n e r a l i z e d tra

18、nsduction)和特异性转导和特异性转导(specialized transduction)。 目录目录 第二节第二节 重组重组DNA技术技术 DNA Recombination 目录目录 重组DNA技术是对携带遗传信息的分子 进行设计和改造的分子工程，包括基因重组 、克隆和表达。 目录目录 重组重组DNA技术的发展史技术的发展史 1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。的豌豆杂交试验。 1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。的肺炎球菌转化实验。 1972年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。分子。 1977年年

19、美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传 工程公司，专门应用重组工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的技术制造医学上重要的 药物。药物。 1980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。技术生产胰岛素的工厂。 1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。英国罗林研究所成功的克隆了多莉。 目录目录 一、基本概念和原理一、基本概念和原理 克隆（克隆（clone）:来自同一始祖的相同副本或来自同一始祖的相同副本或 拷贝的集合。拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(c

20、loning)， 即无性繁殖。即无性繁殖。 （一）（一） DNA克隆克隆 目录目录 技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone) （即（即DNA 克隆）克隆） 细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物） 目录目录 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗 传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、 天然的或人工的天然的或人工的DNA）与载体）与载体DNA接合成一具接合成一具 有 自 我 复 制 能 力 的有 自 我 复 制 能 力 的 D N A 分 子分 子 复 制 子复 制

21、子 (replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛，继而通过转化或转染宿主细胞，筛 选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增 提取获得大量同一提取获得大量同一DNA分子，也称分子，也称基因克隆或基因克隆或 重组重组DNA (recombinant DNA) 。 DNA克隆克隆 目录目录 基因工程基因工程(genetic engineering) 实现基因实现基因 克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，克隆所用的方法及相关的工作称基因工程， 又称重组又称重组DNA工艺学。工艺学。 （二）（二） 重组重组DNA技术技术 生物技术工程生物技术工程: 基因

22、工程、蛋白质工程、酶基因工程、蛋白质工程、酶 工程、细胞工程等工程、细胞工程等 目录目录 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA ，获得感，获得感 兴趣基因的表达产物（蛋白质），这些感兴兴趣基因的表达产物（蛋白质），这些感兴 趣的基因或趣的基因或DNA序列就是目的基因，又称目序列就是目的基因，又称目 的的DNA（target DNA)。 包括包括cDNA和基因组和基因组DNA。 （三）（三） 目的基因目的基因 目录目录 cDNA (complementary DNA) 指经反转录合成的、与指经反转录合成的、与RNA (通常指通常指 mRNA或病毒或病毒RNA)互补的单链互补

23、的单链DNA。以。以 单链单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双为模板、经聚合反应可合成双 链链cDNA。 基因组基因组DNA (genomic DNA) 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息指代表一个细胞或生物体整套遗传信息 (染色体及线粒体染色体及线粒体)的所有的所有DNA序列。序列。 目录目录 二、常用工具酶 目录目录 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别是识别DNA的特异序列的特异序列, 并在识别位点或其并在识别位点或其 周围切割双链周围切割

24、双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G Bam H 定义：定义： 目录目录 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰 系统，限制外源系统，限制外源DNA，保护自身，保护自身DNA。 、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型） 分类：分类： 作用：作用： 目录目录 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株；第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数

25、字表示发现的先后次序。 命名：命名： Hin d 属属 系系 株株 序序 Haemophilus influenzae d株株 流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶 目录目录 类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口 目录目录 Bam H GTC CAG G CCTAG GATCC G GGATCC CCTAGG Hind GTCGAC CAGCTG GAC CTG 平端切口平端切口 粘端切口粘端切口 目录目录 来源不同的限制酶，但能识别和切割来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同一

26、位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G Bam H GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G Bst 同功异源酶：同功异源酶： 目录目录 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，后，产生相同的粘性末端， 称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配 伍末端伍末端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G A TCTAG GAT

27、CT A 同尾酶同尾酶 名称名称 识别序列及切割位点识别序列及切割位点名称识别序列及切割点名称识别序列及切割点 切割后产生切割后产生突出末端突出末端: BamH 5GGATCC.3GATCC.3 Bgl 5AGATCT.3GATCT.3 EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3 Hind Hind 5AAGCTT.3AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3 切割后产生切割后产生3突出末端突出末端: Apa 5GGGCCC.3C.3 Hae 5PuGCGCPy.3Py.3 Kp

28、n 5GGTACC.3C.3 Pst 5CTGCAG.3G.3 Sph 5GCATGC.3C.3 切割后产生平末端切割后产生平末端: Alu 5AGCT.3CT.3 EcoR 5GATATC.3ATC.3 Hae Hae 5GGCC.3CC.3 Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3 Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 目录目录 三、常用载体三、常用载体 定义定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达 有意义的蛋白质所采用的一些有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。可分子。可 按功能分为克隆载体按功能分为克隆

29、载体(cloning vector)和表达和表达 载体载体(expression vector)。 目录目录 克隆载体克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意 设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。 表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。 目录目录 n载体的选择标准：载体的选择标准： 能自主复制；能自主复制； 具有一个以上的遗传标记物，便于重组体具有一个以上的遗传标

30、记物，便于重组体 的筛选和鉴定；的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有插入点），常具有 多个单一酶切位点，称为多克隆位点多个单一酶切位点，称为多克隆位点 (multiple cloning site, MCS)； 分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。 ( 一）克隆载体一）克隆载体(cloning vector) 目录目录 1. 质粒质粒 (plasmid) 特点特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些 遗传信息遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 目录目录 噬菌体噬菌

31、体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆） 2.噬菌体噬菌体(phage) DNA M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因） M13mp系列系列 pUC系列系列 目录目录 互补 互补 目录目录 酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 柯斯质粒载体柯斯质粒载体 ( cosmid vector) n 其他其他 目录目录 （二（二) 表达载体表达载体(expression vector) 目录目录 表

32、达载体表达载体YEpI PT的物理图谱的物理图谱 目录目录 表达载体表达载体pFASTBAC1 的物理图谱的物理图谱 目录目录 目录目录 四、重组四、重组DNA的构建和筛选的构建和筛选 基本原理基本原理 目的基因的获取目的基因的获取 DNA导入受体细胞导入受体细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接 克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建 重组体的筛选重组体的筛选 克隆基因的表达克隆基因的表达 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的 DNA 克克 隆隆 过过 程程 目录目录 （一）目的基因的获取分 1. 化学合成法化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产要求：已知目的基因的核苷

33、酸序列或其产 物的氨基酸序列物的氨基酸序列 。 2. 基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 目录目录 化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。序列。 组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA 基因片断基因片断 克隆载体克隆载体 重组重组DNA分子分子 含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌 限制性内切酶限制性内切酶 受体菌受体菌 基因组基因组DNA文库

34、文库 存在于转化细胞内存在于转化细胞内 由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所 有基因组有基因组DNA的集合的集合 从基因组从基因组DNA文文 库获取目的基因库获取目的基因 限制酶切位点限制酶切位点 限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂左臂 R cos 右臂右臂 真核生物染真核生物染 色体色体DNA 限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体 感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段

35、片段 基因文库基因文库 用随机切割的真核生物染色体用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库片段构建基因文库 mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶 A A A A T T T T AAAA S1S1核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶 碱水解碱水解 T T T T 目录目录 （二）载体的选择和构建（二）载体的选择和构建选选 目的不同，操作基因的性质不同，目的不同，操作基因的性质不同， 载体的选择和改建方法也不同。载体的选择和改建方法也不

36、同。 如：表达体系、表达时限、表达蛋如：表达体系、表达时限、表达蛋 白的定位等白的定位等 目录目录 （二）载体的选择和构建（二）载体的选择和构建选选 表达体系：原核、真核（酵母、昆虫、哺乳动物）表达体系：原核、真核（酵母、昆虫、哺乳动物） 表达时限：稳定表达、瞬时表达表达时限：稳定表达、瞬时表达 表达蛋白的定位：细胞浆、细胞核、细胞外表达蛋白的定位：细胞浆、细胞核、细胞外 目录目录 （三）（三）目的目的DNA与载体与载体连接连接 方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接 (3) 用其它方法获得黏性末端进行连接用其它方法获得黏性末

37、端进行连接 人工接头法人工接头法 同聚物加尾法同聚物加尾法 PCR法法 1. 粘性末端连接粘性末端连接 Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶连接酶 15C GATCC G G CCTAG 目的基因用目的基因用 Bam H切割切割 G CCTAG G CCTAG G CCTAG G CCTAG GATCC G GATCC G GATCC G GATCC G 载体载体DNA用用Bam H切割切割 G CCTAG G CCTAG G CCTAG G CCTAG GATCC G GATCC G GATCC G GATCC G 重组体重组体 G CCTAG G CC

38、TAG GATCC G GATCC G G CCTAG G CCTAG GATCC G GATCC G 目的基因自连目的基因自连 载体自连载体自连 同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 G CTTAA A TCTAG AATTC G GATCT A GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点 AATTC G A TCTAG AATTC G GATCT A AATTC G A TCTAG EcoR+ Bg l 双酶切双酶切 Eco R+ Bg l 双酶切双

39、酶切 G CTTAA A TCTAG AATTC G GATCT A T4 DNA连接酶连接酶 15C 重组体重组体 配伍末端的配伍末端的 连接情况和同一连接情况和同一 限制酶切位点连限制酶切位点连 接相似。接相似。 目录目录 由平端加上新的酶切位点，再用限制由平端加上新的酶切位点，再用限制 酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接头人工接头(linker)连接连接 目录目录 人工接头及其应用人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5- 3- Eco R Eco R Eco R Eco R 目录目录 在末端转移酶在末端转移酶(termin

40、al transferase) 的作的作 用下，在用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制片段末端加上同聚物序列、制 造出粘性末端，再进行粘端连接。造出粘性末端，再进行粘端连接。 同聚物加尾连接同聚物加尾连接 目录目录 目录目录 2. 平端连接平端连接 限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端 适用于：适用于： 3. 黏黏平连接平连接 目的基因目的基因 载体载体 限制性内切酶限制性内切酶 限制性内切酶限制性内切酶 T4 DNA连接酶连接酶 15C 重组体重组体 载体自连载体自连 目的基因目的基因 自连自连 平端连接平端连接 目录目录

41、 受体菌条件：受体菌条件： 安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷 处于感受态处于感受态(competent) 导入方式：导入方式： 转化转化 (transformation) 转染转染 (transfection) 感染感染 (infection) （四）重组（四）重组DNA导入受体细胞导入受体细胞转转 目录目录 1. 遗传标志筛选遗传标志筛选 (1) 抗生素标记筛选抗生素标记筛选 (2) 标志补救标志补救(marker rescue) （五）重组体的筛选（五）重组体的筛选筛筛 n 重组重组DNA分子被导入受体细胞后，需要设法将众多的转化分子被导入受体细胞后，需要设法将众

42、多的转化 菌落或菌斑区分开来，并鉴定得到目的基因的克隆，这一菌落或菌斑区分开来，并鉴定得到目的基因的克隆，这一 过程即为筛选过程即为筛选(screening)。 ( (插入失活法 插入失活法) ) 抗生素标记选择 抗生素标记选择 互补 互补 目录目录 2. 序列特异性筛选序列特异性筛选 （1）限制性内切核酸酶酶切法）限制性内切核酸酶酶切法 （2）PCR法法 （3）核酸杂交法）核酸杂交法 原位杂交 原位杂交 Southern印迹印迹 鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出 免疫学方法免疫学方法 3. 亲和筛选亲和筛选 目录目录 表达体系的建立：表达体系的建立： 表达载体的构建表达载体的

43、构建 受体细胞的建立受体细胞的建立 表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化 （六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达 目录目录 标准：标准：选择标志选择标志 强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点 表达产物易于分离、纯化，表达融合蛋白是常表达产物易于分离、纯化，表达融合蛋白是常 用的策略。用的策略。 E.coli表达体系的不足表达体系的不足： 不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA； 不能加工表达的真核蛋白质；不能加工表达的真核蛋白质； 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body) ； 很难表达大量可溶性蛋白。很

44、难表达大量可溶性蛋白。 1. 原核表达体系原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用表达体系最为常用) 大鼠胰岛素原大鼠胰岛素原cDNA 的表达和分泌的表达和分泌 目录目录 优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累表达产物分区域积累 缺点：缺点：操作技术相对难、费时、经济操作技术相对难、费时、经济 转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程 方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染 电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2.

45、2.真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动物细胞）真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动物细胞） 目录目录 细胞裂解液细胞培养上清 目录目录 目录目录 第三节第三节 重组重组DNA技术在医学技术在医学 中的应用中的应用 目录目录 一、基因工程药物及疫苗的研制一、基因工程药物及疫苗的研制 利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多 肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将 有望成为有望成为2121世纪的支柱产业。世纪的支柱产业。 美国美国Eli Lilly公司于公司于19821982年首先利用重组年首先利用重组 DNADNA技术合成人

46、胰岛素并投放市场，标志着技术合成人胰岛素并投放市场，标志着 生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有 5050多种基因工程药物上市，近千种处于研发多种基因工程药物上市，近千种处于研发 状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生 了不可估量的社会效益和经济效益。了不可估量的社会效益和经济效益。 目录目录 重组重组DNA医药产品医药产品 产产 品品功功 能能 组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝 血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血 颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生

47、成 促红细胞生成素促红细胞生成素剌激红细胞生成剌激红细胞生成 生长因子生长因子(bFGF, EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化 生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症 胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病 干扰素干扰素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤 白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤 单克隆抗体单克隆抗体 利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿 瘤导向治疗瘤导向治疗 乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)预防乙肝预防乙肝 口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱

48、菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱 目录目录 基因诊断基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子利用分子 生物学及分子遗传的技术和原理，在生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水水 平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、 缺失或插入等突变。缺失或插入等突变。又称又称DNA诊断诊断 。 二、基因诊断 n 概念概念 目录目录 基本过程：基本过程： 区分或鉴定区分或鉴定DNA的异常的异常 分离、扩增待测的分离、扩增待测的DNA片断片断 目录目录 能正确扩增靶基因；能正确扩增靶基因； 能准确区分单个碱基的差别；能准确区分单个碱基的差别； 本底或噪

49、声低，不干扰本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定的鉴定; 便于完全自动化操作，适合大面积、便于完全自动化操作，适合大面积、 大人群普查。大人群普查。 标准：标准： 目录目录 1. 产前诊断产前诊断 2. 携带者测试携带者测试 3. 症候前诊断症候前诊断 4. 遗传病易感性遗传病易感性 基因诊断包括：基因诊断包括： 目录目录 三、基因治疗 定义定义 基因治疗基因治疗(gene therapy)是向有功能缺是向有功能缺 陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补 偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。 方式方式 体细胞基因治疗体细胞基

50、因治疗 (somatic cell gene therapy) 生殖细胞基因治疗生殖细胞基因治疗 (germ line gene therapy) 目录目录 一些例子 1991年，美国批准了人类第一个体细胞基因治疗；临床年，美国批准了人类第一个体细胞基因治疗；临床 实验方案，利用表达实验方案，利用表达ADA的逆转录病毒治疗重度联合免疫的逆转录病毒治疗重度联合免疫 缺陷综合症（缺陷综合症（SCID） 同年，复旦大学进行了世界上首例血友病同年，复旦大学进行了世界上首例血友病B的基因治疗临的基因治疗临 床试验，通过反转录病毒介导的基因转移，自体皮肤成纤床试验，通过反转录病毒介导的基因转移，自体皮肤成纤 维细胞能高效地分泌人凝血因子维细胞能高效地分泌人凝血因子 目录目录 一些例子（基因治疗药物） 2004年，我国第一个基因治疗药物获批，即深圳年，我国第一个基因治疗药物获批，即深圳 SiBiono GeneTech 的的 p53 基因治疗药物基因治疗药物 Gendicine，用于头颈癌治疗，用于头颈癌治疗 2012年年10月，荷兰公司月，荷兰公司UniQure研发的研发的“Glybera”药物药物 （AAV-LPL）获得欧盟批准，用于治疗脂蛋白酯酶缺乏遗）获得欧盟批准，用于治疗脂蛋白酯酶缺乏遗 传病（传