液相杂交检测B细胞淋巴瘤细胞系miR.doc

1、液相杂交检测 B 细胞淋巴瘤细胞系 miR 【摘要】 microRNA (miRNA) 是一组在进化上高度保守、非编码蛋 白、参与转录后调节的小分子RNA (19-25 核苷酸)。为了进一步 明确 miRNA 的加工机制及功能和定量研究 miRNA 的表达水平，应 用液相杂交和 Northern blot 两种方法检测 miR-28 在 B 细胞淋巴瘤细 胞系中的表达并进行了比较。结果表明：液相杂交和 Northern blot 检测 miR-28 均显出阳性结果，但液相杂交所用的细胞总 RNA 量 (5 g明显少于 Northern blot (30血)，液相杂交的条带信号也 较 North

2、ern blot 的强。结论：液相杂交是一种较 Northern blot 更为 快速、简便和敏感的检测 miR-28 的方法。 【关键词】 淋巴瘤 Expression of miR-28 in B Cell Lymphoma Cell Lines Detected by Solution Hybridization Abstract microRNA (miRNA) is evolutionarily conserved， noncoding small RNA (19-25 nt) involved in post-transcriptional gene regulation.To f

3、urther understand the biogenesis and functions of miRNA， and to quantify miRNA expression levels， the expression of miR-28 in B lymphoma cell lines pared.The results indicated that detection of miR-28 by solution hybridization and Northern blot shoount used for solution hybridization detection iR-28

4、 in B cell lymphoma cell lines is a faster and more sensitive method as pared iRNA; lymphoma; miR-28 microRNA(miRNA) 是一种大小约 19-25 个碱基的单链小分子 RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经 过切酶(dicer)加工后生成1。miRNA在线虫、果蝇、小鼠和 人等多个物种中被广泛发现，而且在进化上高度保守，在人类已经 发现有222个miRNA。目前对miRNA的研究不断深入，并认为这 些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。 由

5、于 miRNA 是一类很小的分子，它的表达水平可能很低，因而需要极为 灵敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用 RT-PCR 的方法来定 量研究非常困难，目前研究人员多采用 Northern blot 方法来检测 miRNA 的存在 2。传统的 Northern blot 方法是用探针检测固相 支持物(膜)上的目标分子，由于用探针检测液相中的目标分子远 比检测固相中的目标更为灵敏，本研究采用液相杂交(solution hybridization)的方法检测4种B细胞淋巴瘤细胞系中 miR-28的表 达。miR-28基因是22个碱基的单链小分子 RNA，是由具有发夹结 构的 86 个碱基的单链

6、RNA 前体经过切酶加工后生成，位于染色体 3q27-28 的含 LIM 的脂肪瘤多见融合伙伴( LIM-containing lipoma preferred partner， LPP )基因中。 材料和方法 细胞系 B 细胞淋巴瘤细胞系 HRC57、RCK8、BEVA 和 OCL-LY8 ，采 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，于37C、5% CO2及恒定 湿度条件下培养。 细胞总 RNA 的提取 总 RNA 提取 采用TRIzoL试剂（Life tech no logies公司）进行RNA 一步法提 取。取对数生长期细胞 1X107,经预冷的PBS洗涤，移入离心管 中，加入1

7、 ml TRIzoL，混匀，室温静置15分钟；加入0.2 ml氯 仿，振荡15秒，静置3分钟；4C、 000Xg离心15分钟，取上 清；加入 0.5 ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置 10 分 钟；4C、 000Xg离心10分钟，弃上清；加1 ml 75%乙醇，轻轻 洗涤沉淀；4C、7 500X3离心5分离，弃上清；风干，加入适量的 DEPC H2O溶解；-80 C保存备用。 RNA 定量 取适当稀释的 RNA 样品，分别在紫外分光光度计 260 nm 和 280 nm波长下读数，按1 OD值40 g/ L RNA计算RNA的含量。 miR-28 探针制备 采用 mirVanaTM

8、miRNA Probe Construction Kit （Ambion 公司） 制 备 探 针 。 miR-28 的 序 列 为 ： 5 AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG 3；设计 miR-28 探针为：在 3端另外增加8个和T7启动子互补的碱基5； CCTGTCTC3 ；将这段 寡核苷酸和 T7 启动子引物退火，用 Kleno 收集与整理，。 A 转录模 版，然后与 T7 RNA聚合酶、rNTP和标记物（a32P UTP）混 合，体外37C作用30分钟，转录得到标记的小分子 miR-28探针5； GAGACAGGCUCAAUAGACUGU GAGCUCCUU 3； DNase

9、I 于 37C,作用10分钟消化多余的双链 DNA转录模版。具体操作参照 产品说明书进行。 Northern blot RNA 电泳 首先制备 15%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶，在离心管中混合待测 细胞系总RNA （30讥和加样缓冲液（5 Q1 , 95-100C变性3分 钟，立即置冰浴，加样，恒流（20 mA）进行电泳，分离分子量大 小不同的RNA。待溴酚蓝移至胶长的2/3时中止电泳，紫外灯下观 察 RNA 质量。 转膜 用半干转移法（semi-dry transfer）将RNA从变性胶转移到 Hybond 尼龙膜上( Amersham Biosciences 公司)( 200 mA ，30 分

10、 钟)， UV 交联。预杂交 将膜的反面紧贴杂交瓶，加入杂交液 (Amersham Biosciences公司)10 ml, 42C预杂交 3 小时。 杂交 将变性的同位素标记的 miR-28探针(95-100C变性5分钟，冰 浴5分钟)20 加入到杂交液中，42C杂交4小时或过夜。 洗膜倾去杂交液，用 2XSSC/0.1%SDS/DEPC水，42 C洗 20 分钟，2 次；再用 1WSC/0.1%SDS/DEPC水，42 C洗 20 分钟，2 次。 显影 用薄型塑料纸将膜包好，置于暗盒中，在暗室中压上 X 光片。 暗盒置-80 C放射自显影2-3天左右检测结果。液相杂交 用 mirVanaT

11、M miRNA Detection Kit ( Ambion 公司)进行，首 先将同 位素标记的 miR-28 小分子探针进行凝胶纯化( gel purification )，然后与待检测细胞系总RNA (5 g混合，95- 100C变性3分钟后于42 C杂交2小时或过夜。基于核酶保护分析 方法，用单链核酸酶 RNase A/T1 消化未杂交的 RNA 和多余的探 针，于37 C作用1小时。然后用RNase/PPT溶液225卩使核酸酶失 活，并加等量的100%乙醇，于-20 C条件下，作用30分钟沉淀杂交 的RNA分子，4C、 000旳离心15分钟，弃上清，风干10分钟， 与加样缓冲液5卩混合

12、，95-100C变性3分钟，加样于15%尿素变 性聚丙烯酰胺凝胶，恒流(20 mA)电泳至待溴酚蓝移至胶长的 2/3 时停止，用薄型塑料纸将凝胶包好，置于暗盒中，在暗室中压上 X 光片。暗盒置-80C放射自显影1-2天检测结果。具体操作参照产品 说明书进行。 结果 细胞总 RNA 提取 用本方法所提取的细胞总 RNA 的 D (260)/D (280) 和 D (260)/D (230) 都在 2.0 左右，说明 RNA 样品未受到蛋白质、苯酚和碳水化 合物的污染。 RNA 电泳时 18 S 和28 S rRNA 的条带清晰，无拖尾 现象，说明 RNA 的纯度和完整性都很好。 miR-28 探

13、针制备 用 mirVanaTM miRNA Probe Construction Kit 制备的探针经 15% 尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后放射自显影，在 30个碱基处可见明 显清晰的条带，说明探针标记良好。 Northern blot 和液相杂交两种方法检测 miR-28 的结果比较 从附图中可以看出： miR-28 在 HRC57、 RCK8、 BEVA 和 OCL- LY8 细胞系中的表达是不一致的。 Northern blot 和液相杂交两种方法 均检出阳性结果；液相杂交所用细胞总 RNA为5 g Northern blot 为30而液相杂交结果条带信号较更强，说明液相杂交检测 miR

14、-28 较 Northern blot 方法敏感。 讨论 RNA 一度被认为仅仅是 DNA 和蛋白质之间的 “过渡阶段 ”，但 越来越多的证据表明， RNA 在生命的进程中扮演的角色远比我们先 前设想的更为重要。RNA干扰（RNA interferenee）的发现使得人们 对 RNA 调控基因表达的功能有了全新的认识，更因为可以简化或替 代基因敲除而成为研究基因功能的有力工具，因此格外引人注意。 miRNA 是一种大小 19-25 nt 的单链小分子 RNA ，最早被确认的 miRNA 是在线虫中的 lin-4 3和 let-71， 4，到目前为止已经 有将近 1 400 个 miRNA 在包

15、括人类、果蝇、植物等多种生物物种中 被报道。随着对这些 miRNA 的基因序列、加工表达方式、生理功 能等方面日益深入研究发现， miRNA 发挥着非常重要的基因表达调 节作用，可以从一种全新的角度来认识基因及其表达调节的本质。 2002 年美国科学杂志评出的年度十大科技突破中， miRNA 的 发现名列榜首。 近年来， miRNA 在恶性疾病中的作用引起很大的关注，认为 miRNA 在肿瘤发病中起重要作用 5。 Calin 等 6研究发现， 50%以上的 miRNA 基因定位于与肿瘤相关的区域或脆性区域。在恶 性淋巴增殖性疾病中， miRNA 直接参与染色体的缺失，大约 50%的 CLL 中

16、有染色体 13q14 的缺失， miR-15 和 miR-16 基因定位于染色 体的13q14位置上，在慢性淋巴细胞白血病（CLL ）病人中发现这2 个基因的表达有缺失或下调现象存在 2。 Eis 等 7研究发现， 在一些B细胞淋巴瘤，包括弥漫性大 B细胞淋巴瘤（DLBCL ）中 miR-155 的拷贝数较正常循环中 B 细胞高 10-30倍。活化 B 细胞型 DLBCL的miR-155拷贝数明显高于生发中心型 DLBCL，且前者具 有较差的预后，故认为 miR-155 的表达量可以作为 B 细胞淋巴瘤的 诊断和预后指标。 Calin 等 8运用基因芯片技术对 CLL 样本中数 百个 miRN

17、A 前体和 miRNA 进行检测，根据结果将 CLL 分为两 组，且与 CLL 疾病状态和 ZAP-70 的表达有关，认为 miRNA 的表 达与此类白血病的生物学和临床行为密切相关。 由于 miRNA 可能参与分化 9、发育10、组织生长 11、 脂肪代谢等生理过程，在不同的组织和发育阶段的表达水平有 所不同，进一步了解 miRNA 的生物功能需要确定其在各种生物样 品中的表达水平，因而需要一种精确的定量纯化方法，以便得到可 信的数据。随着 miRNA 日益收受到研究人员的重视，很多研究 miRNA 的新方法 3 不断推出。 miRNA 探针的制备方法比较简单，只需要准备目的基因的一小段 寡

18、核苷酸序列，3端另外增加8个和T7启动子互补的碱基，与 T7 启动子引物退火，用 KlenoiRNA 探针。这种方法可以快速制备各种 标记(同位素、非放射性)的小于 100 核苷酸的 miRNA 探针，适 用于包括液相杂交， Northern blot 和原位杂交等各种方法检测核内 小仁 RNA( small n uclear RNA，sn RNA)、小干扰 RNA (siRNA)、 miRNA和mRNA。非放射性标记的探针还可以用于原位杂交研究 miRNA 或者 mRNA 在组织中的分布。 本研究运用的基于核酶保护分析的液相杂交方法，将同位素标记好 的 miRNA 探针和待检测样品进行混合杂交，未杂交的RNA 和多余 的探针用单链核酸酶消化，然后使核酸酶失活，杂交的RNA 分子最 后通过变性胶电泳放射自显影检测结果。此方法不但操作简单快 速，而且灵敏度极高可以半定量检测少至 10 ng 总 RNA 模板中的 miRNA，或者说，可以检测阿托摩尔(attomole即10-18 mol)级的 靶目标，灵敏度是 Northern blot 的 100 倍，还可以在同一个样品中 同时检测多个 miRNA 和长的 RNA 模板，为从事 miRNA 实验研究 带来方便。 此外，现行的 RNA 纯化方法包括有机溶剂抽提 +乙醇沉淀，或者