测定蛋白酶活力实验

1、测定蛋白酶活力实验一、实验目的1. 加深了解酶活力的概念。2. 学习掌握测定蛋白酶活力的方法。二、实验原理酶活力指酶催化某一特定反应的能力。 其大小可用在一定条件下酶催 化反应进行一定时间后， 反应体系中底物的减少量或产物的生成量来 表示。酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。 本实验规定酶活力单位 (U) 为一定条件下每分钟分解lag酪氨酸所需的酶量。实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。 产物酪 氨酸在碱性条件下与 Folin- 酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化 合物在680nm处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。 因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化， 可

2、计算出蛋白酶的 活力。三、仪器和试剂仪器: 恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。 原料枯草杆菌蛋白酶：称取1g枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.02mol/L , pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。 使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀 释。试剂1.Folin- 酚试剂：在2L磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO2H2O)100g,钼酸钠(Na2WoO2H2O)25g,蒸馏水 700mL 85%磷酸 50mL以及浓盐酸 100mL充分混匀后，微火回流加热10小时。再加入硫酸锂150g,蒸馏水50mL 和液溴数滴，摇匀后开

3、口继续煮沸15mi n,以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中 暗处贮藏。使用前用标准NaOH溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为 2mol/L) ,然后加水稀释至 1mol/L ,即可使用。2. 0.2mol/L 盐酸溶液3.0.04mol/L 氢氧化钠溶液4.0.55mol/L 碳酸钠溶液5.10%三氯乙酸溶液6.0.02mol/LpH7.5 磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2HPQ12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A液);称 取磷酸二氢钠(Na2HPQ12H2Q)3.12g，用水定容至100mL(B液)。取A 液84mL B液16mL

4、混合后，得到0.2mol/LpH7.5磷酸缓冲液，可长 期存放。临用时稀释 10倍即可。7.标准酪氨酸溶液(50卩g/mL):称取12.5mg以烘干至恒重的酪氨酸，用0.2mol/L盐酸约30mL溶解后，蒸馏水定容至250mL8.酪蛋白溶液（0.5%）:称取1.25g酪蛋白，用0.04mol/L氢氧化钠溶 液（20mL）溶解，再用0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液定容到250mL四、操作步骤（ 一 ） 酪氨酸标准曲线的制作取 6支试管 （标号 0， 15） ，按顺序分别加入 0.00， 0.20， 0.40， 0.60，0.80和1.00mL标准酪氨酸溶液，再用水补足到1.00mL，摇匀后

5、各加 入0.55mol/L碳酸钠5.0mL，摇匀。依次加入Folin 酚试剂1.00mL, 摇匀并计时，于30C水浴锅中保温15min。然后680nm处测定吸光值 （以0号管作对照）。以酪氨酸含量（卩g）作横坐标，吸光值为纵坐标 绘制标准曲线。（ 二 ） 酶活力测定30C水浴中预热5分钟，再加入1.0mL已预热好的枯草杆菌蛋白酶液， 立即计时，水浴中准确保温10min,从水浴中取出后，立即加入2.0mL 的 10%三氯醋酸溶液，摇匀静置数分钟，干滤纸过滤，收集滤液（样品液）。另取一试管，先加入1.0mL已预热好的枯草杆菌蛋白酶液和 2.0mL30C水浴保温10min,同样干滤纸过滤，收集滤液（对照液）。 以上两过程,应各做一次平行实验。2. 滤液中酪氨酸含量的测定取3支试管，分别加入1.0mL水、A液、B液，然后各加入5.0mL0.55mol/L 碳酸钠溶液和 1.00mLFolin- 酚试剂,摇匀按标准曲 线制作方法保温并测吸光度值。根据吸光度值,由标准曲线查出 A、B液中酪氨酸含量差值，即可推算出酶的活力单位。五、计算酶活力单位数少刃=样品7对照