色谱方法学验证

1、色谱方法学验证所谓方法验证 （validation ，又叫认证 ）就是要证明所开发方法的实用性和可靠性。实用性 一般指所用仪器配置是否全部可作为商品购得（实验室自己制造的仪器部件就欠实用 ），样品处理方法是否简单易操作， 分析时间是否合理， 分析成本是否可被同行接受等。 可靠性则包 括定量的线性范围、检测限、方法回收率、重复性、重现性和准确度等。下面就简单讨论这 几个可靠性参数。1方法的线性范围即检测器响应值与样品量 （浓度 ）成正比的线性范围，它主要由检测器的特性所决定。原 则上。这一线性范围应覆盖样品组分浓度整个变化范围。 线性范围的确定通常是采用一系列 （多于 3 个） 不同浓度的样品进

2、行分析，以峰面积（或峰高 ）对浓度进行线性回归。当相关系数大于0. 99时，就可认为足线性的，小于0. 99时，就超出了线性范围。一个好的GC定量方法，其线性范围 （以 FID 检测器为例 ）可达 10；，线性相关系数等于或大于0 9999。2. 方法的检测限检测限（DL）是指方法可检测到的最小样品量 （浓度）。一般的原则是按照3倍信噪比计算， 即气样品组分的响应值等于基线噪声的 3倍时， 该样品的浓度就被作为最小检测限， 与此对 应的该组分的进样量就叫做最小检测量-此外。 忆验证定量方法时， 还将 10倍信噪比所对应的样品浓度叫做最小定量限， 当用于法规分析时， 这一数据应等于或低于法规方法

3、所要求的 实际样品中待测组分的最低允许浓度。检测限的测定可用一个接近检测限浓度的样品进行分析，据所得色谱峰的峰高来计算。设此时浓度为c、相应的峰高为h（信号强度单位）、基线噪声为N（与h的单位相同），则检测 限可按下面公式计算：c/ h = DL/3N ;即 DL = 3Nc/ h噪声的大小与仪器的性能， 特别是检测器及其电子电路的稳定性直接相关， 也与载气的 纯度、 色谱柱的性能及操作条件有关。噪声的测定是在正常操作条件下，仪器稳定时，将信号放大 （降低衰减或放大纵坐标 ）来测量，一般是测定样品出峰前后 1min 的基线噪声。作为分析方法，检测限无疑是越低越好。为此，应选择灵敏度高的检测器，

4、使用高纯 度的载气和辅助气， 同时要定期维护仪器， 保持进样口和检测器的清洁， 保持色谱柱的性能。 此外，仔细优化分离条件、适当加大进样量 （如采用大体积进样技术 ）也是降低检测限的常用 方法。3. 方法回收率 即方法测得的样品组分浓度与原来样品中实有浓度的比率。如果样品未经任何预处理，则回收率一般可不考虑。 只有当某些样品组分被仪器系统不可逆吸附时， 回收率才是需要考 虑的问题。 如果样品经过了预处理， 如萃取工艺， 那就必须考虑整个方法的回收率。一般要 求回收串大于 60，越接近 100越好。回收率可用下述简单方法测定：配置一定浓度的标准样品，将其两等分，其中一份按 方法步骤进行预处理，然

5、后用 GC 分析。另一份则不经颈处理而直接用 GC 分析。两份样品所得待测组分峰面积的比率乘以 100 即是该组分的回收率。 有时实际样品很复杂， 特别是样 品基质对预处理的回收率影响较大时，就必须用空白样品基质(确信不含待测物 )制备标准样品，比如测定废水中有机农药残留量时， 就要采用不含农药的水作空白基质， 在其中加入已 知量的农药标准品， 然后进行处理和分析。 处理后测得的组分含量与处理前加入量的比率乘 以 100 就得到了回收率。很显然，回收率太低时会影响方法的检测限。当样品处理过程较复杂时，应分步测定 回收率，最后针对回收率最低的步骤进行方法改进，以期提高整个方法的回收率。4方法重复

6、性和重现性重现性 (reproducibility) 足指同一方法在不同时间、地点、不同型号仪器、不同操作人员 使用寸所得结果的一致性。与此近似的另一个术语是重复性 (repeatability) ，常指同一个人在 同一台仪器上重复进样所得结果的一致性。 事实上， 文献中二者常常混用， 多数人不做严格 区分。 但大多数欧洲学者会严格区分二者的不同。我们认为对现代仪器来说， 分析重复性是容易实现的， 而重现性则是更重要的， 也是方法验证所必须考察的。 重现性和重复性都用多 次分析所得结果的相对标准偏差 (RSD) 来表示。方法的重现性应包括多次连续进样分析的重复性、不同时间 (天与天之间 ) 分

7、析的重复 性、不同型号仪器之间的重现性和不同实验室之间的重现性。 作为方法开发人员， 首先应测 定重复性，即在相同条件下连续进样510 次，统汁待测组分的保留时间和峰面积 (或峰高 )的RSD, 般要求保留时间的 RSD不大于1 %，峰面积的 RSD不大于5%。文献报道的最 佳重复性数据为保留时间的 RSD 小于 0.1%，峰面积的 RSD 小于 1%。如果样品要经过预处理，还应测定同一样品多次处理的重复性。即同一样品取35 份做平行处理，看最后测定结果的重复性。这一 RSD 值应不大于 5%。当然，有些工业分析 要求不大于 10%即可。至于天与天之间的重现性也不应大于10%、当上述重复性满足

8、要求后，说明该方法在你的实验室是可靠的。要将此方法作为标准 方法推广使用，还必须测定不同仪器、不同实验室之间的重现性。当这些重现性(RSD)都能满足要求时。这一方法的可靠性就得到了较为满意的验证。方法的线性关系及检测限准确称取 7 种目标物的标准品 , 用甲醇稀释配制成 7 种目标物的标准溶液 , 根据需要 用甲醇分别稀释配制成 5 级标准工作溶液 , 浓度范围如表 3 所示 ,在选定的色谱条件下 ,分 别进样分析。 以峰面积为纵坐标 ,浓度为横坐标作回归方程 ,结果见表 3 , 回归方程的相关系 数 R2 均大于 0.9999, 线性关系良好。以最低浓度标样重复进样 5 次, 取其 3 倍标

9、准偏差 为检测限 , 10 倍标准偏差为定量限 , 根据样品处理过程将结果换算为ug /g , 得到该方法的检测限和定量限方法的回收率和重复性采用标准加入法测定方法的回收率。取一种已知目标物含量的样品( 7 # ) , 加入与其含量相当的混合标 准溶液 ,重复 5 次 ,测定其加标回收率和重复性 , 结果如表 5 所示。 5 次重复实验的 RSD 范 围为 1 . 3 % 3 . 1 %, 回收率范围为 97 . 0 % 99 . 6 %,可以满足定量需要。引自RP-HPLC法测定烟用香精香料中的 7种防腐剂 内标法方法学注意事项（引自网页论坛） 选一与欲测组分相近但能完全分离的组分做内标物（

10、当然是样品中没有的组分） ，然后配制 欲测组分和内标物的混合标准溶液， 进样得相对校正因子。 再将内标物加入欲测组分的样品 中，进样后测得欲测组分和内标物的定量参数。用内标法公式计算即可。内标法是将一定量的纯物质作内标物， 加入到准确称量的试样中， 根据被测试样和内标物的 质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分的含量。 选择内标物有 4 个要求： 1. 内标物应是该试样中不存在的纯物质； 2. 它必须完全溶于试样中， 并与试样中各组分的色谱 峰能完全分离； 3. 加入内标物的量应接近于被测组分； 4. 色谱峰的位置应与被测组分的色谱 峰的位置相近，或在几个被测组分色谱峰中间。 内标法的

11、优点是测定的结果较为准确，由 于通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的， 因而在一定程度上消除了操 作条件等的变化所引起的误差。 内标法的缺点是操作程序较为麻烦， 每次分析时内标物和试 样都要准确称量， 有时寻找合适的内标物也有困难。 外标法简便， 但进样量要求十分准确， 要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行， 否则造成分析误差， 得不到准确的测量结果。那么内标法的方法学研究就是将过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值， 也就是一个比 值，来进行一些精密度、准确度、线性之类的研究。 具体就是配制不同浓度的标准溶液，记录样品和内标峰面积，计算样品 / 内标峰面积比值 R 样品/

12、内标，利用样品浓度 C对比值R样品/内标作直线回归，得回归方程，作为标准曲线。 精密度、准确度也如此。 首先你要了解何为内标法 内标法是一种间接或相对的校准方法。 在分析测定样品中某组分含量时， 加入一种内标物质 以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。 影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、 色谱方面的和仪器方面的三 类。由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。 化学方面的因素包括：1、内标物在样品里混合不好；2、内标物和样品组分之间发生反应，3、内标物纯度可变等。对于一个比较成熟的方法来说， 色谱方面的问题发生的

13、可能性更大一些， 色谱上常见的一些 问题 （如渗漏 ）对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则要小一些，但如果绝对面积的变 化已大到足以使面积比发生显著变化的程度， 那么一定有某个重要的色谱问题存在， 比如进 样量改变太大， 样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别，检测器非线性等。 进样量应足够小并保持不变， 这样才不致于造成检测器和积分装置饱和。如果认为方法比较可靠， 而色谱固看来也是正常的话， 应着重检查积分装置和设置、 斜率和峰宽定位。 对积分装置发生怀 疑的最有力的证据是：面积比可变，而峰高比保持相对恒定， 在用内标法做色谱定量分析时， 先配制一定重量比的被测组分和内标样品的混合物做色

14、谱分 析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线， 此曲线即为标准曲线。在实际样品分析时 所采用的色谱条件应尽可能与制作标准曲线时所用的条件一致，因此，在制作标准曲线时， 不仅要注明色谱条件 （如固定相、柱温、载气流速等 ），还应注明进样体积和内标物浓度。在 制作内标标准曲线时， 各点并不完全落在直线上， 此时应求出面积比和重量比的比值与其平 均位的标准偏差，在使用过程中应定期进行单点校正，若所得值与平均值的偏差小于2，曲线仍可使用，若大于 2，则应重作曲线，如果曲线在铰短时期内即产生变动，则不宜使用内标法定量。所以， 当你确定应用内标法之后， 就不需要进行这些实验的。 因为你在加内标时它就是一个 已知浓度了。做方法学的时候，内标和待测物标准品 （比如你的白三烯待测物）要分别单独 进样，然后再做标液的色谱图（含有内标和样品） ，然后再是提取或者回收后的样品（如血 浆或者一些细胞，组织提取物等等） ，最后比较两者的封面积。如果内标选择用来做方法回收率的， 在样