病毒的血凝及血凝抑制试验

1、病 毒 的 血 凝 及 血 凝 抑 制 试 验有些病毒具有凝集某种（些）动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集 （HA）试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集 红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制（HI）试验，具有特异性。通过 HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和 滴定抗体的含量。目的要求掌握病毒 HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。材料与试剂1.96孔“ U”形或“ V”形微量反应板，50 L定量移液器，滴头，微型振荡器。2. 生理盐水，0.5% 鸡红细

2、胞悬液。3. 新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。实验内容及操作方法（一）血球凝集 （HA）试验1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50 :L生理盐水。2. 于左侧第1孔加50 I病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50 :L至第2孑L,依次倍比稀释至第11孑L,吸弃 50 L ；第12孔为红细胞对照。3. 自右至左依次向各孔加入0.5%鸡红细胞悬液 50 ?L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表 4-1 ）。表4-1病毒血凝试验的操作方法（单位：L）孑L号123456789101112病毒稀释度1:21:41:81:161:321:641:

3、1281:2561:5121:10241:2048对照生理盐水50 50 50 150.5050)50 -|50 150 50 ,5050病毒液卜50* 50卜*50、50、50卜5050 -* 50505叫0.5%红细胞5050505050505050505050 50弃50结果观察+ + + +4.结果判定：从静置后10 min 开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100%凝集（+），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。以100%凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128

4、，则1:128 为1个血凝单位，1:64、1:32 分别为 2、4个血凝单位，或将 128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。（二）血球凝集抑制（HI）试验1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制岀4个血凝单位的病毒液。2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50 T生理盐水。3. 第1孔加被检鸡血清50 :L,吹吸混合均匀，吸50 :L至第2孑L,依此倍比稀释至第10孔，吸弃50 L，稀释度分别为：1: 2、 1:4、1:8；第12孔加新城疫阳性血清50 1，作为血清对照。4. 自第1孔至12孔各加50 :L 4个血凝单位的新城疫病

5、毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10mi n 。5. 自第丨孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液 50 ?L，振荡混合均匀，室温下静置后观察结 果（表4-2 ）。纟结果观察-+-6. 结果判定：待病毒对照孔（第 11孑L）岀现红细胞100%凝集（+），而血清对照孔（第12孑L）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。以100 %抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。从表 4-2 看出，该血清的 HI 效价为 1:64 ，用以 2 为底的负对数 （-log2） 表示

6、，即 6log2附录1. 阿氏液（ Alsever ）：即红细胞保养液枸橼酸钠（ 5H2O） 0.80g枸橼酸（ H2O）0.055g葡萄糖2.05g氯化钠0.42g双蒸水 加至 100 ml将以上试剂加热溶解于双蒸水中，调整pH至6.8 , 115 C灭菌10min,4 C保存备用。2. 0.5% 鸡红细胞制备方法先用灭菌注射器吸取 3.8% 枸橼酸钠溶液 （其量为所需血量的 15） ，从鸡翅静脉或心脏采2 倍，以 2000r/min 离心 10min ，血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的 弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需 用量，用灭菌生理盐