中药资源与开发专业教学指南编写人员

1、(六)滑石粉烫(1)刺猬皮 将滑石粉置热锅内,用中火加热,至灵活状态时,倒入净刺猬皮,炒至刺尖卷曲,内部膨胀时取出.筛去滑石粉,放凉.每100kg刺猬皮,用滑石粉.本文档由无尘大哥上传至豆丁网中药资源与开发专业教学指南编写人员主 编：肖深根副主编：谢 玲 谢红旗参 编：钟晓红 杨建奎 蒋道松 邓林伟 彭克勤 谢 玲 谢红旗 肖深根夏志兰 王仁才 刘东波 李大志 主 审：钟晓红 罗军武 目 录中药资源与开发实践教学指南1药用植物学教学实习实践教学大纲37生物化学与分子生物学实验技术教学大纲52植物生理学实验技术教学大纲79中药资源学教学实习实践教学大纲130药用植物功能成分分析实验教学大纲160

2、药用植物栽培学实验教学大纲179药用植物遗传育种学实验教学大纲199中药炮制加工学实验教学大纲232中药炮制加工学教学实习实践教学大纲239药用资源研究法实验教学大纲254中药资源与开发专业毕业实习教学大纲258中药资源与开发专业生产实习教学大纲26392中药资源与开发实践教学指南生物化学与分子生物学实验技术教学大纲实验课程号： 20571b1学时：32 学分：1.5分适用对象：植保、植科、园艺、农学、农资、生态、茶学、草业、中药资源与开发等课程属性：必修先修课程：无机及分析化学、基础化学实验、有机化学、生化及分子生物学考核方式：笔试闭卷考试使用教材及主要参考书：杨虹琦主编，生物化学实验教程，

3、湖南农业大学自编教材，1999俞建瑛主编，生物化学实验技术，化学工业出版社，2005周先碗主编，生物化学仪器分析与实验技术，化学工业出版社，2002郝福英主编，生命科学实验技术，北京大学出版社，2004王镜岩主编，生物化学，高等教育出版社，2002李庆章主编，生物化学，中国农业出版社，2004阎隆飞主编，分子生物学，中国农业大学出版社，1997王关林主编，植物基因工程，科学出版社，2002刘约权主编，现代仪器分析，中国农业科技出版社，1998一、课程的性质与任务生物化学与分子生物学实验技术（以下简称为生物化学实验技术）在生命科学的发展中起着非常重要的基础作用，它与农业、林业、食品、医药和环保等

4、领域都有着十分广泛而又密切的联系，并且已成为生命科学研究中的最基础手段之一。因此，生物化学实验技术是大学本科生物类、农学类、园林类、食品类等专业的必修实验课程。 生物化学实验技术课程主要是培养学生在生物化学方面的实践能力和创新能力。它的作用不仅仅是以形象生动的实验现象帮助学生加深理解与掌握生化理论知识，而且是培养学生将生化理论知识应用于生产实践，提高学生的动手操作能力，提高在实践中发现、分析和解决问题的能力，提高开拓创新精神的有效途径。二、实验的目的与基本要求通过生物化学实验技术课程教学，应该使学生初步掌握生物化学常用实验基本操作技术；同时增加感性认识，巩固生化理论知识；培养学生严肃认真、实事

5、求是的科学态度和作风；提高学生分析和解决问题的能力；在生化实验上具备一定的独立创新和设计能力。三、实验项目一览表生物化学及分子生物学实验技术实验项目一览表序 实验项目 实验 实验 适用 学 号 名称 类型 要求 专业 时 1 蛋白质含量测定 验证性 必做 中药资源与开发 4 2 蛋白质构像变化的紫外光谱检测 设计性 选做 中药资源与开发 43 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白 验证性 必做 中药资源与开发 44 糖含量的测定 验证性 必做 中药资源与开发 4 5 谷物总淀粉测定 验证性 必做 中药资源与开发 4 6 核酸含量测定 综合性 必做 中药资源与开发 4 7 淀粉酶活及动力学 设计性 必做

6、 中药资源与开发 88 过氧化氢酶固定化及酶活测定 设计性 必做 中药资源与开发 49 核黄素含量测定 综合性 必做 中药资源与开发 410 凝胶柱层析分离核黄素和血红蛋白 设计性 必做 中药资源与开发 411 sds电泳测定蛋白质分子量 综合性 选做 中药资源与开发 1212 植物组织总dna提取与纯度鉴定 综合性 选做 中药资源与开发 1213 质粒的提取、酶切与鉴定 综合性 必做 中药资源与开发 12 14 pcr基因扩增及鉴定 综合性 选做 中药资源与开发 12四、实验项目的具体内容：实验一 蛋白质含量测定考马斯亮兰g250法1本次实验的目的和要求学习考马斯亮兰染料结合法测定蛋白质的原

7、理和方法；学习721、7230型分光光度计的使用方法；掌握低速离心机使用方法。2实验内容或原理考马斯亮兰g250是一种染料，能与蛋白质稳定结合，结合蛋白质后变为青色，在595nm处有最大吸收，在一定蛋白质浓度范围内（01000g / ml），蛋白质染料结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。3需用的仪器或试剂等仪器：721或7230型分光光度计、离心机、50ml容量瓶等玻璃器皿试剂：牛血清白蛋白（1000g/ml）、考马斯亮兰g250溶液、0.1mol / l naoh溶液、70乙醇材料：小麦粉或大米粉4实验步骤（1） 蛋白质标准曲线或回归方程的制作；（2

8、） 蛋白质的提取；（3） 考马斯亮兰法测定蛋白质含量。5教学方式学生课前结合生物学实验室网站资源自学预习；教师在课堂里通过黑板或多媒体讲解实验，并对关键步骤进行示范操作；最后学生在教师的指导监督下，完成实验操作和实验报告。6考核要求（1）掌握考马斯亮兰测定蛋白质含量的原理和方法。（2）怎样根据蛋白质的溶解性选择溶剂。（3）熟悉标准曲线或回归方程的制作方法。7实验报告要求实验项目和步骤填写完整；有原始数据，结果符合真实值；有适当的实验现象描写和实验结果分析；字迹工整，书写整洁。实验二 ph对牛血清蛋白构象影响的紫外光谱分析1本次实验的目的和要求理解蛋白质构象变化的实质及其研究方法；了解紫外-可见

9、双光束分光光度计的使用。2实验内容或原理蛋白质的紫外吸收光谱主要是由于芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基的生色团作用产生，蛋白质的紫外吸收光谱中，一般210nm处的峰是肽键的强吸收峰，280nm附近的峰是酪氨酸残基的吲哚环、色氨酸残基的酚基的吸收峰。大多数蛋白质在280nm波长附近有一个吸收峰。蛋白质的紫外光谱会受到溶剂的ph值影响，因为溶剂的ph值影响生色团的解离状态，从而引起蛋白质构象变化，改变其吸收光谱，因此利用紫外光谱法可以初步考察蛋白质的构象变化。3需用的仪器或试剂等仪器：具塞试管、移液管、水浴锅、紫外-可见双光束分光光度计试剂：0.1 mol/l ph=5、8、13 的nah

10、2po4缓冲液 ；0.1mg/ml 酪氨酸和 色氨酸 ；10 mg/ml 材料：牛血清蛋白（bsa）4实验步骤（1）样品在不同ph值的缓冲液下处理；（2）紫外光谱检测、分析。5教学方式学生课前结合生物学实验室网站资源自学预习；教师在课堂里通过黑板或多媒体讲解实验，并对关键步骤进行示范操作；最后学生在教师的指导监督下，完成实验操作和实验报告。6考核要求（1）理解蛋白质构象变化的实质及其研究方法；（2）了解紫外-可见双光束分光光度计的使用。（3）提交实验报告，并分析讨论实验结果。7实验报告要求实验项目和步骤填写完整；有原始数据，结果符合真实值；有适当的实验现象描写和实验结果分析；字迹工整，书写整洁

11、。实验三 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白1本次实验的目的和要求学习蛋白质电泳的一般原理与方法；掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离蛋白技术；熟悉电泳仪的使用方法。2实验内容或原理将蛋白质置于ph值低于其等电点的电极缓冲溶液中，则蛋白质将带正电荷而向负极移动。因为蛋白质分子在电场中移动的速度与其带电量、分子的形状及大小有关，所以，可用电泳法将不同的蛋白质分离开来。3需用的仪器或试剂等仪器：电泳仪、电泳槽、镊子、盖玻片、细玻棒等 试剂：醋酸纤维素薄膜、ph8.6巴比妥缓冲液（离子强度0.060.07）、染色液、漂洗液、透明液材料：健康人血清或鸡血清4实验步骤（1） 血清的制备；（2） 了解各种电泳方法和电泳仪

12、的作用；（3） 血清蛋白电泳分离。5教学方式学生课前结合生物学实验室网站资源自学预习；教师在课堂里通过黑板或多媒体讲解实验，并对关键步骤进行示范操作；最后学生在教师的指导监督下，完成实验操作和实验报告。6考核要求（1）掌握蛋白质电泳的原理；（2）了解影响蛋白质电泳因素；（3）醋酸纤维素薄膜电泳的优缺点；（4）绘出血清蛋白电泳分离图谱。7实验报告要求实验项目和步骤填写完整；有原始数据，结果符合真实值；有适当的实验现象描写和实验结果分析；字迹工整，书写整洁。实验四 糖含量的测定（蒽酮法）1本次实验的目的和要求 掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和技术；熟悉721、7230型分光光度计的使用；清除蒽酮

13、法测糖含量的注意事项。2实验内容或原理 糖类遇浓硫酸将脱水生成糠醛或其衍生物，糠醛或羟甲基糠醛进一步与蒽酮试剂缩合产生蓝绿色物质，其在可见光区620nm波长处有最大吸收，且其光吸收值在一定范围内与糖的含量成正比关系。从而可以利用光吸收值测定出糖的含量。3需用的仪器或试剂等仪器：721或7230型分光光度计、恒温水箱、100ml容量瓶等玻璃器皿；试剂：200gml标准葡萄糖、蒽酮试剂、浓硫酸；材料：蔬菜4实验步骤（1）材料中可溶性糖的提取；（2）蒽酮比色法测定糖含量。5教学方式 学生课前结合生物学实验室网站资源自学预习；教师在课堂里通过黑板或多媒体讲解实验，并对关键步骤进行示范操作；最后学生在教

14、师的指导监督下，完成实验操作和实验报告。6考核要求（1）掌握721或7230型分光光度计的操作。（2）掌握蒽酮比色法测定糖含量的原理、方法和注意事项。（3）提交实验报告，并分析讨论。7实验报告要求 实验项目和步骤填写完整；有原始数据，结果符合真实值；有适当的实验现象描写和实验结果分析；字迹工整，书写整洁。实验五 谷物总淀粉的测定1本次实验的目的和要求掌握用旋光法测定谷物淀粉含量的原理和方法；掌握旋光仪的使用方法；了解不同作物淀粉的标准比旋光度值。 2实验内容或原理淀粉因含有不对称碳原子，故具有旋光性。在加热条件下，淀粉可分散于稀盐酸溶液中，用磷钨酸沉淀蛋白质等其他旋光物质后，将溶液定容到一定体

15、积。利用旋光仪测定出淀粉溶液的旋光偏振角。根据不同作物淀粉的比旋光度d20，可计算出总淀粉的含量。3需用的仪器或试剂等仪器：旋光仪、恒温水箱、100ml烧杯、50ml容量瓶、研钵、玻棒、漏斗试剂：1mol/l 盐酸、4磷钨酸材料：稻米粉4实验步骤（1）谷物淀粉的提取；（2）旋光仪法测定谷物淀粉含量。5教学方式学生课前结合生物学实验室网站资源自学预习；教师在课堂里通过黑板或多媒体讲解实验，并对关键步骤进行示范操作；最后学生在教师的指导监督下，完成实验操作和实验报告。6考核要求（1）掌握旋光仪的使用方法。（2）旋光法为什么能测定淀粉含量。（3）提交实验报告，并分析讨论。7实验报告要求实验项目和步骤

16、填写完整；有原始数据，结果符合真实值；有适当的实验现象描写和实验结果分析；字迹工整，书写整洁。实验六 核酸含量的测定定磷法1本次实验的目的和要求掌握定磷法测定核酸含量的原理和操作方法；掌握消化技术。2实验内容或原理rna和dna中都含有磷酸，根据分析，含磷量平均约为9.5，dna含磷量平均约为9.9。即根据核酸样品中测得的含磷量就可以计算出或含量。测定核酸中磷含量的原理是先将有机磷全部消化变成无机磷，然后通过磷钼酸铵显色反应来测定其含磷量。3需用的仪器或试剂等仪器：消化仪（或者消化瓶、电炉）、721或7230型分光光度计 、恒温水箱、容量瓶等玻璃器皿试剂：10mol/l硫酸溶液、30过氧化氢溶

17、液、2.5钼酸铵溶液、定磷试剂、沉淀剂等实验材料：干酵母粉4实验步骤（1）核酸的提取和消化；（2）定磷法测定核酸的含量。5教学方式学生课前结合生物学实验室网站资源自学预习；教师在课堂里通过黑板或多媒体讲解实验，并对关键步骤进行示范操作；最后学生在教师的指导监督下，完成实验操作和实验报告。6考核要求（1）掌握定磷法测定核酸含量的原理和方法；（2）掌握核酸消化的注意事项；（3）提交实验报告，并分析讨论。7实验报告要求实验项目和步骤填写完整；有原始数据，结果符合真实值；有适当的实验现象描写和实验结果分析；字迹工整，书写整洁。实验七 淀粉酶活性及酶动力学1本次实验的目的和要求学习和掌握淀粉酶的测定方法

18、，了解水稻生长与之代谢的关系；熟悉-淀粉酶与-淀粉酶的特性及活性测定的原理；熟悉酶动力学原理。2实验内容或原理淀粉酶能将淀粉水解成麦芽糖，由于麦芽糖能将3,5二硝基水杨酸试剂还原成3氨基5硝基水杨酸的橙红色化合物，且在一定范围内还原糖的浓度与反应液的颜色成正比，故利用比色法可求出麦芽糖的含量。3需用的仪器或试剂等仪器：721或7230型分光光度计、离心机、恒温水箱、研钵等玻璃器皿试剂：淀粉溶液、ph5.6柠檬酸缓冲液、0.4mol/l氢氧化钠溶液、3,5-二硝基水杨酸试剂等材料：萌发的水稻种子4实验步骤（1）提取水稻淀粉酶的粗酶液；（2）酶促反应水解淀粉；（3）-淀粉酶和-淀粉酶总活性测定（4

19、）酶动力学研究。5教学方式学生课前结合生物学实验室网站资源自学预习；教师在课堂里通过黑板或多媒体讲解实验，并对关键步骤进行示范操作；最后学生在教师的指导监督下，完成实验操作和实验报告。6考核要求（1）怎样分别测定-淀粉酶和-淀粉酶；（2）酶活性的表示方法；（3）提交实验报告，并分析讨论。7实验报告要求实验项目和步骤填写完整；有原始数据，结果符合真实值；有适当的实验现象描写和实验结果分析；字迹工整，书写整洁。实验八 过氧化氢酶固定化及酶活测定1本次实验的目的和要求学习和掌握过氧化氢酶活性的测定原理和方法；掌握吸附法和包理法固定过氧化氢酶，以比较不同方法固定酶的效果。2实验内容或原理采用海藻酸钙包

20、埋和活性炭吸附法固定过氧化氢酶，通过测定固定酶的比活性，海藻酸钙回收，固定化效率来比较其固定化效果。过氧化氢酶能催化过氧化氢分解为水和氧。在过氧化氢酶液中加入一定量的过氧化氢，反应一定时间后，终止酶的活性，剩余的过氧化氢，以钼酸铵作催化剂，与碘化钾反应，游离出的i2用淀粉作指示剂，用硫代硫酸钠溶液滴定到蓝色消失为止，根据空白和测定二者之差，即可求出被酶分解的h2o2量，从而求出过氧化氢的酶活性。3需用的仪器或试剂等仪器：恒温水箱、酸式滴定管、滴定台、蝴蝶夹、容量瓶、研钵等玻璃器皿 试剂：碳酸钙（固体）、0.1mol/l na2s2o3、3.6mol/l h2so4 、10%钼酸铵、1%淀粉、

21、20%ki、0.1mol/l h2o2、碳酸钙（固体）、海藻酸钠材料：白菜叶4实验步骤（1）过氧化氢粗酶液的提取；（2）过氧化氢固定化酶的制备；（3）过氧化氢酶活性的测定。5教学方式学生课前结合生物学实验室网站资源自学预习；教师在课堂里通过黑板或多媒体讲解实验，并对关键步骤进行示范操作；最后学生在教师的指导监督下，完成实验操作和实验报告。6考核要求（1）过氧化氢固定化酶的制备方法（2）过氧化氢酶活性的测定原理、步骤及表示方法。（3）过氧化氢酶促反应的最适条件是什么？（4）提交实验报告，并分析讨论。7实验报告要求实验项目和步骤填写完整；有原始数据，结果符合真实值；有适当的实验现象描写和实验结果分

22、析；字迹工整，书写整洁。实验九 维生素b2（核黄素）的测定荧光法1本次实验的目的和要求掌握荧光分光光度计的使用；学习荧光法测定维生素b2（核黄素）的原理和方法。2实验内容或原理核黄素在370nm和440nm的光照下产生荧光,发射波长是560nm。在稀溶液中荧光强度与核黄素浓度成正比。用连二亚硫酸钠将核黄素还原，根据还原前后的荧光差数，计算核黄素的含量。色素的干扰可用高锰酸钾氧化法除去。3需用的仪器或试剂等仪器：荧光分光光度计、恒温水箱、试管等玻璃器皿试剂：1mol/l氢氧化钠溶液、1mol/l盐酸溶液、3%高锰酸钾溶液、1%双氧水、冰醋酸、连二亚硫化钠（又称保险粉）、核黄素标准贮备液、核黄素标

23、准应用液材料：小麦粉4实验步骤（1） 小麦粉中核黄素的提取纯化；（2） 荧光法测定核黄素的含量。5教学方式学生课前结合生物学实验室网站资源自学预习；教师在课堂里通过黑板或多媒体讲解实验，并对关键步骤进行示范操作；最后学生在教师的指导监督下，完成实验操作和实验报告。6考核要求（1）掌握荧光分光光度计的使用；（2）掌握荧光法测定维生素b2（核黄素）的原理和方法；（3）提交实验报告，并分析讨论实验结果。7实验报告要求实验项目和步骤填写完整；有原始数据，结果符合真实值；有适当的实验现象描写和实验结果分析；字迹工整，书写整洁。实验十 凝胶柱层析分离核黄素和血红蛋白1本次实验的目的和要求了解葡聚糖凝胶的特

24、性；掌握凝胶柱层析技术及其分离蛋白质的基本原理和操作方法；熟悉分离层析仪（紫外检测仪、部分收集器、恒流泵和随机电脑软件）的使用。2实验内容或原理凝胶层析的原理是基于分子排阻过滤。本实验用交联葡聚糖凝胶作支持物，用核黄素（黄色，相对分子质量267）和血红蛋白（红色，相对分子质量67000）混合物作为样品，在层析时，前者相对分子质量小，可进入凝胶网孔，所受阻力大，移动速度慢；后者相对分子质量大，不能进入凝胶网孔，而从凝胶颗粒间隙流下，所受阻力小，移动速度快。从而该两种组分分离。3需用的仪器或试剂等仪器：ma99-3分离层析仪（上海沪西分析仪器厂）、移液枪、滴管试剂：交联葡聚糖（sephadex）

25、g-25或g-50、核黄素饱和水溶液、血红蛋白溶液（40mg/ml）、0.2mol/l氯化钠溶液（离子强度为0.08）材料：核黄素、血红蛋白混和液4实验步骤（1）葡聚糖凝胶柱的制备；（2）分离层析仪的调试使用；（3）凝胶柱层析分离纯化核黄素和血红蛋白。5教学方式学生课前结合生物学实验室网站资源自学预习；教师在课堂里通过黑板或多媒体讲解实验，并对关键步骤进行示范操作；最后学生在教师的指导监督下，完成实验操作和实验报告。6考核要求（1）掌握凝胶柱层析的原理和操作步骤（2）学会分离层析仪的使用（3）了解具有分子筛效应的凝胶主要有哪些（4）提交实验报告，并分析讨论实验结果。7实验报告要求实验项目和步骤

26、填写完整；有原始数据，结果符合真实值；有适当的实验现象描写和实验结果分析；字迹工整，书写整洁。实验十一 sds电泳测定蛋白质分子量1. 本次实验的目的和要求掌握sds聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的基本原理和技术；学会聚丙稀酰胺凝胶的配制。2实验内容或原理sds-凝胶电泳测定蛋白质分子量（mr）的机理主要是在蛋白质溶液中加入sds及巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；sds能使蛋白质分子的氢键、疏水键打开，去折叠，伸展的蛋白质分子与sds结合，形成蛋白质-sds复合物。由于sds分子的十二烷基硫酸根带负电荷，因此使不同蛋白质的sds-蛋白质复合物都带上相同密度的负电荷，且所带

27、的负电荷量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同种类蛋白质分子间的电荷差异。蛋白质分子与sds结合后，蛋白质分子变性，构象发生变化，蛋白质-sds复合物是近似于雪茄烟形状的长椭圆棒。这样的蛋白质-sds复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响。电泳迁移率仅仅取决于蛋白质mr这一主要物化参数。在蛋白质mr范围内，电泳迁移率与mr的对数呈线性关系。3需用的仪器或试剂等仪器：电泳仪（600v，恒流，恒压）、垂直平板电槽、微量注射器（100l）、1ml自动取液器、玻璃注射器及注射针头、自动吸引器、干燥器、抽气装置。试剂：丙烯酰胺凝胶贮备液、10

28、%过硫酸铵、10%sds溶液、染色液。实验材料：牛血清蛋白（bsa）、低mr标准蛋白质混合物4实验步骤（1）制备聚丙稀酰胺凝胶；（2）上样电泳；（3）染色测量迁移率，计算蛋白质分子量5教学方式学生课前结合生物学实验室网站资源自学预习；教师在课堂里通过黑板或多媒体讲解实验，并对关键步骤进行示范操作；最后学生在教师的指导监督下，完成实验操作和实验报告。6考核要求（1）掌握sds聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的基本原理和技术；（2）提交实验报告，并分析讨论实验结果。7实验报告要求实验项目和步骤填写完整；有原始数据，结果符合真实值；有适当的实验现象描写和实验结果分析；字迹工整，书写整洁。实验十二

29、植物组织总dna提取与纯度鉴定1本次实验的目的和要求掌握植物dna分离纯化的基本原理和操作技术；学会使用紫外分光光度计；掌握dna纯度的检测方法。2实验内容或原理植物组织中的dna提取过程中用表面活性剂（如sds）溶解核蛋白体上的蛋白质，使核蛋白体解聚后释放出核酸。提取液中的蛋白质可用蛋白质变性剂（如氯仿、酚等）变性沉淀，rna可通过用rnase处理除去。然后利用dna分子易溶于水而不溶于有机溶剂的性质，用乙醇或异丙醇沉淀即可分离得到所需的dna分子。用核酸纯溶液的a260 和 a230消光值之比，可以用来鉴定dna的纯度。3需用的仪器或试剂等仪器：高速冷冻离心机、紫外分光光度计、恒温水箱、液

30、氮罐、移液枪、研钵等玻璃器皿 试剂：dna提取液、氯仿：异戊醇（24：1）混合液、5mol / l高氯酸钠溶液、ph8.0 te溶液、95%乙醇、3 mol / l 醋酸钠溶液实验材料： 新鲜水稻幼苗4实验步骤（1）植物基因组总dna的提取和分离纯化（2）用紫外分光光度法检测dna的纯度5教学方式学生课前结合生物学实验室网站资源自学预习；教师在课堂里通过黑板或多媒体讲解实验，并对关键步骤进行示范操作；最后学生在教师的指导监督下，完成实验操作和实验报告。6考核要求（1）掌握植物dna提取和纯化原理和操作步骤；（2）根据dna的纯度指标a 260 /a 280 1.8，dna片段大于20kb考核实

31、验结果；（3）提交实验报告，并分析讨论实验结果。7实验报告要求实验项目和步骤填写完整；有原始数据，结果符合真实值；有适当的实验现象描写和实验结果分析；字迹工整，书写整洁。实验十三 质粒的提取、酶切与鉴定1本次实验的目的和要求理解基因工程载体的性质和特点；掌握提取质粒dna的常用方法；掌握质粒dna酶切的操作方法；掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定方法。2实验内容或原理碱变性抽提质粒dna是基于染色体dna的变性与复性的差异而达到分离的目的。利用溶菌酶、强碱(naoh)及表面活性剂(sds)使细胞破壁、膜，释放出胞内染色体dna，质粒dna及其它物质，通过一系列的纯化过程：高盐除核dna，苯酚-氯仿抽提变性

32、蛋白和脂类，最后用异丙醇(或乙醇)沉淀出质粒dna和rna等， rna再经rnase消化，得到质粒dna，这种质粒dna可用作基因工程的载体，更广泛地用于重组子的鉴定。3需用的仪器或试剂等仪器：可调微量取样器（20l、200l、1000l）、1.5ml eppendorf管、常用玻璃器皿、高压灭菌锅、恒温空气摇床、台式高速微量离心机、旋涡振荡器、恒温水箱、琼脂糖凝胶电泳系统、紫外反射透射仪、凝胶自动成像系统。 试剂： 1溶液1(gte) 50 mmol/l 葡萄糖，10 mmol/l edta-na2，25 mmol/l tris-cl (ph8.0)，4mg/ml 溶菌酶； 2. 溶液2 2

33、00 mmol/l naoh，1% sds； 3. 溶液3 5 mol/l kac 60 ml，冰乙酸 11.5ml，ddh2o 28.5ml；4. 苯酚 氯仿；5.异丙醇(或95%乙醇,100%乙醇)；6. 70%乙醇；7.te (ph 8.0)， 10 mmol/l tris.cl (ph8.0) 1 mmol/l edta-na2；8. rnase 1mg/ml amp 100ug/ml。实验材料：大肠杆菌4实验步骤（1）挑取单菌落在液体培养基中振荡培养过夜；（2）离心、收集细菌；（3）用碱裂解液裂解细菌；（4）用等量体积的酚：氯仿抽提菌液；（5）用异丙醇沉淀dna后，离心收集沉淀；（6

34、）用70%乙醇洗涤沉淀，并离心收集沉淀后干燥；（7）溶解dna于去离子水或te中，保存备用；（8）质粒的限制性内切酶酶切；（9）琼脂糖凝胶电泳鉴定。5教学方式学生课前结合生物学实验室网站资源自学预习；教师在课堂里通过黑板或多媒体讲解实验，并对关键步骤进行示范操作；最后学生在教师的指导监督下，完成实验操作和实验报告。6考核要求（1）理解基因工程载体的性质和特点（2）掌握小量制备质粒dna的方法及原理（3）掌握质粒dna酶切的操作方法（4）掌握各步的操作要点7实验报告要求实验项目和步骤填写完整；有原始数据，结果符合真实值；有适当的实验现象描写和实验结果分析；字迹工整，书写整洁。实验十四 pcr基因

35、扩增及鉴定1本次实验的目的和要求掌握pcr反应的基本原理和方法。2实验内容或原理聚合酶链式反应（pcr）的原理类似于dna的天然复制过程。在微量模板dna、引物、四种脱氧核苷酸、耐热dna聚合酶和镁离子等存在的情况下，经过变性、退火和延伸若干个循环后，dna可扩增2n，n=循环次数。然后dna琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增效果。3需用的仪器或试剂等仪器：pcr仪、琼脂糖凝胶电泳系统、紫外反射透射仪、凝胶自动成像系统试剂：pcr全套试剂盒、琼脂糖粉、电泳缓冲液材料：dna4实验步骤（1）在eppendorf管中加入pcr反应物；（2）进行程序扩增；（3）对扩增产物进行dna琼脂糖凝胶电泳检测。5教学方式

36、学生课前结合生物学实验室网站资源自学预习；教师在课堂里通过黑板或多媒体讲解实验，并对关键步骤进行示范操作；最后学生在教师的指导监督下，完成实验操作和实验报告。6考核要求（1）掌握pcr的原理和方法；（2）掌握pcr的原理和方法；（3）提交实验报告，并分析讨论实验结果。7实验报告要求实验项目和步骤填写完整；有原始数据，结果符合真实值；有适当的实验现象描写和实验结果分析；字迹工整，书写整洁。五、教改说明及其他 本次教改的目的是为了强化学生的生物化学与分子生物学实验技能和创新设计能力。在实验项目的设计上，尽可能的使用了生物学实验室最新购入的先进设备；同时压缩了一些验证性实验，增加了一些创新性、设计性

37、和综合性实验。这些改革符合实验教学的发展趋势，突出了实验教学的重要地位，提高学生了综合实验水平。课程负责人：生物科学技术学院，邓林伟。二o o 八年一月植物生理学实验技术教学大纲1实验课程号：20587b22课程属性：（必修）3实验属性：独立设课4学时学分：总学时20、总学分15实验应开学期：春季6先修课程：植物学实验、生物化学实验一、课程的性质与任务植物生理学实验技术在生物科学的发展中起着很重要的作用，它与工业、农业、食品、医药和环保等各领域都有着十分广泛而又密切的联系，并且它已成为生命科学研究中非常重要的手段。植物生理学实验技术是生物学实验中重要组成部分。植物生理学实验技术是农业生产种植类

38、专业及其相关专业的少数几门主干课程之一，属于专业基础课，也是必修实验课。植物生理学实验技术课程主要是培养学生的实践能力和创新能力。它的作用不仅仅是以形象生动的实验现象帮助学生加深理解与掌握理论知识，而且是培养学生将理论知识应用于生产实践，提高学生的动手操作能力，在实践中发现问题、分析问题、解决问题的能力和培养开拓创新精神的有效途径。二、实验的目的与基本要求植物生理学是一门实验性学科，它之所以能够得到迅速发展，与植物生理学实验技术的突飞猛进密切相关。因此，植物生理学实验技术课程是植物生理学教学的重要组成部分，加强和改进实验教学是提高植物生理学教学质量的重要环节。要求四年制农大本科相关专业学生熟练

39、掌握以下三种基本功：1 通过实验，增加感性认识，印证和强化基本理论知识。2 掌握重要植物生理指标的测定方法及相关的仪器使用方法。3 训练观察实验现象，记录、分析实验数据和写作实验报告的能力。培养学生严肃认真、实事求是的科学态度和科学作风；提高学生分析问题和解决问题的能力。在教学过程中，要求学生每次实验前预习好实验指导的有关内容；掌握实验的目的和实验设计原理；了解实验操作的基本过程及注意事项。上实验课时教师必需认真讲解实验内容和操作要点，细心指导和演示操作步骤；学生应仔细观察实验中出现的各种现象，如实记录实验结果和数据，并联系有关理论内容积极思考，力求理解每一实验步骤及实验结果的意义；书写实验报

40、告要求简明扼要、字迹清楚、规范整洁、结果正确；实验过程中应注意勤俭节约，安全有序。实验结束后应及时清洗仪器，打扫实验室卫生，关闭好门窗水电；教师必需认真负责地巡视检查实验课的各个环节，并认真评阅好实验报告。三、实验考核方式及办法植物生理学实验课程采用笔试和操作技能相结合的办法进行，笔试以百分制计分，技能操作按a（优秀）、b（良好）、c（及格）和d（不及格）评价。四、实验项目一览表植物生理学实验项目一览表序号实验项目名称实验类型实验要求适用专业学时1植物组织水势的测定（小液流法）设计性必做农科类32植物组织渗透势的测定（质壁分离法）综合性必做农科类33叶绿体色素的提取及定量测定验证性必做农科类4

41、4叶绿体色素的分离及理化性质观察综合性必做农科类45植物种子生活力的快速测定验证性必做农科类36植物根系活力的测定（ttc法）验证性必做农科类3五、实验项目的具体内容：实验一 植物组织水势的测定（小液流法）1实验目的掌握植物组织水势的组成；掌握小液流法测定植物组织水势的方法。2实验内容成熟细胞水势主要决定于压力势（ p）和渗透势（ s）。对于外液（如蔗糖溶液）而言，只具有水势或渗透势 s=-icrt，r、t均为常数，先要知道蔗糖重量摩尔浓度c，则可知蔗糖溶液水势。该实验的目的是求得细胞水势，其中的 p很难测定，故只有把细胞水势与蔗糖溶液水势联系起来，间接利用蔗糖溶液的渗透势计算公式求出细胞水势

42、。怎样将两者联系起来是该实验的关键。将已知浓度的蔗糖溶液分装于两个容器中，在其中一个加入植物材料，这样就将植物细胞与蔗糖溶液处于一个系统之中，依水分总是从水势高的区域向水势低的区域移动的原理，当植物细胞水势与蔗糖溶液水势不相等时，它们之间就有水分移动，主要有以下三种情形：水势大小水分移动方向蔗糖溶液（比重）变化小液滴移动方向 w细胞 w糖液糖液细胞增加下沉 w细胞 w糖液动态平衡不变原处扩散 w细胞 w糖液细胞糖液减少上升因此，如果液滴在原处扩散，即表示浓度不变，此溶液浓度的水势就等于植物组织的水势，而蔗糖溶液的水势 w = icrt，只要知道蔗糖溶液的重量摩尔浓度c，即可知其水势，我们观察时

43、，如没有原处扩散现象，则取上升与下降的两相邻试管所对应的蔗糖浓度的平均值作为公式中的c。3需用的仪器或试剂（1）仪器设备：带刻度试管；弯头滴管；镊子；打孔器；培养皿。（2）试剂：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mol/l蔗糖溶液；甲烯蓝粉末。4实验步骤（1）取0.10.6m蔗糖溶液各10ml于大试管中；分取2ml于对应的青霉素瓶和分取3ml于对应指形管。（2）在每个青霉素瓶中各放20片叶圆片，不时摇动，30min后，各加微量的甲烯兰充分摇匀，显浅兰色。（3）用弯头毛细管吸一小滴溶液挤入对应的指形管中，同时观察液滴移动情况，记录结果于下表：蔗糖浓度（m）0.60.50.40.30.

44、20.1液滴移动方向（4）结果计算：w =icrt（巴）其中i=1，r=0.008mpakgmol-1k-1 ，c为等渗浓度（mol/l）。c=(下沉最高浓度+上升最低浓度)/25教学方式：室内实验6考核要求掌握植物组织水势的测定方法。7实验报告要求：按时提交实验报告。实验二 植物组织渗透势的测定（质壁分离法）1实验目的练习利用质壁分离法测定植物细胞的渗透势。2实验内容植物细胞的水势由渗透势、压力势、衬质势组成，因成熟细胞内衬质势一般可忽略不计，因而在测定渗透势时，由于渗透势随植物细胞的体积变化比较微小，当植物组织处在某种浓度的溶液中发生初始质壁分离，并且组织细胞内的汁液周围的溶液处于渗透平衡

45、时，细胞内的压力势为零，此时植物组织的渗透势就等于外部溶液的渗透势。将植物组织放在浓度呈现梯度的一系列蔗糖水溶液中，然后观察质壁分离现象，找到刚刚引起初始质壁分离时的浓度和与其邻近的尚不能引起质壁分离的浓度，则压力势等于零时的等渗浓度介于其间，而 s=icrt，即可近似地求出其渗透势，而蔗糖的解离系数i=1。3需用的仪器或试剂（1）仪器设备：显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、刀片、（小）烧杯、移液管、培养皿。（2）试剂：0.03%中性红溶液；0.1m0.6m的蔗糖梯度浓度溶液。4实验步骤(1) 将洋葱（大蒜）切成都11cm2的小块，撕下内表皮或外表皮，放在培养皿中，加入25ml 0.03%的中性红

46、溶液染色1015min。如是有颜色的外表皮可以不染色。(2) 取出内表皮或外表皮,用吸水纸吸干染料，迅速分别投入各种浓度的蔗糖溶液中（每一浓度至少一片，将其完全浸入。(3) 10min后，从高浓度开始依次取出表皮薄片，放在滴有同样溶液的载玻片上，盖上盖玻片，镜检，并记录质壁分离的相对程度。实验中必须确定一个引起半数以上细胞原生质刚刚从细胞壁的角隅上分离的最低浓度以及不引起质壁分离的最高浓度。细胞的渗透势近似地与这两个极限溶液浓度之平均值所对应的渗透势相等。 (4) 测出引起质壁分离刚开始的蔗糖溶液最低浓度c1和与其相邻的不引起质壁分离最高浓度c2之后，可按公式计算在常压下该组织细胞的渗透势：

47、s=icrt=c0.0083t r气体常数，0.0083mpakgmol-1k-1 t绝对温度 i解离常数，蔗糖等于1 c等渗透溶液的重量摩尔浓度；c=(c1+c2)/2蔗糖浓度（m）质壁分离的细胞百分率（%）质壁分离相对程度（作图）0.600.500.400.300.200.105教学方式：室内实验6考核要求掌握植物组织渗透势的测定方法。7实验报告要求：按时提交实验报告。实验三 叶绿体色素的提取及定量测定1实验目的掌握光合色素的提取和定量测定方法。2实验内容根据朗伯比尔定律，某有色溶液的吸光度d与其中溶液浓度c和液层厚度l成正比，即：a=kcl。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长

48、下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需用测定该提取液在三个特定波长下的吸光度a，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于红光区和蓝紫光区，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。已知叶绿素a、b的80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm。又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的吸光系数分别为82.04和9.27，在波长645nm下，分别为16.75和45.

49、60，可根据加和性原则列出以下关系式：a663=82.04ca+9.27cb (1)a645=16.75ca+45.60cb (2)式 (1)、（2）中的a663和a645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的吸光度；ca、cb分别为叶绿素a和b的浓度，以mg/l为单位。解方程组（1）、（2），得：ca=12.7a663-2.69a645 (3)cb=22.9a645-4.68a663 (4)将ca与cb相加即得叶绿素总量ct：ct=ca+cb=20.2a645+8.02a663 (5)由于叶绿素a、b在652nm的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为34.5），也可以在此波长下测定

50、一次吸光度（a652）而求出叶绿素a、b总量：ct=ca+b=a6521000/34.5 (6)丙酮提取液中类胡萝卜素的含量：ck=4.7a440-0.27ca+b (7)3需用的仪器或试剂（1）仪器设备：分光光度计、天平、研钵、棕色容量瓶、小漏斗、定量滤纸、吸水纸、擦镜纸、滴管。（2）试剂：80%丙酮、石英砂、碳酸钙粉4实验步骤（1） 取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎，混匀。（2） 称取剪碎的新鲜样品0.2g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及23ml80%丙酮，研成匀浆，再加80%丙酮5ml，继续研磨至组织变白。（3） 过滤收集至25ml容量瓶中，用少量80%丙酮冲洗研钵、研棒及残

51、渣数次，最后用80%丙酮定容至25ml，摇匀。（4） 将上述色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以80%丙酮为空白，在波长663nm、645nm、652nm和440nm下测定光密度。（5） 结果计算将测得的光密度值代入公式，分别计算chla、chlb、chla+chlb和类胡萝卜素的浓度（mg/l）。并按下式计算组织中单位鲜重中各色素的含量：稀释倍数：若提取液未经稀释，则取1。5教学方式：室内实验6考核要求掌握光合色素的提取和定量测定方法。7实验报告要求：按时提交实验报告。实验四 叶绿体色素的分离和理化性质的观察1实验目的了解植物叶绿体的色素的组成，掌握叶绿体色素提取、分离的方法，掌握各种光合

52、色素理化性质的鉴定。2实验内容提取：植物叶绿体色素是吸收可见太阳光能，进行光合作用的重要物质。它一般由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。分离：色素分离的方法有多种，纸层析是最简便的一种。当溶剂（有机推动剂）不断从纸上流过时，由于混合色素中各种成分在固定相（滤纸纤维素上所吸附的水分）和流动相（有机推动剂）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。皂化作用：叶绿素是一种二羧酸（叶绿酸）与甲醇和叶绿醇形成的酯，故可与碱起皂化反应而生成醇和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。3需用的仪器或试剂（1）仪器设备：研钵、漏斗、剪刀、滴管、大试管（带胶塞）、大头针、滤纸、天平、电吹风、量筒、毛细管。（2）试剂：80%丙酮；石英砂；碳酸钙粉；推动剂(石油醚:丙酮=4 v:1 v)；4实验步骤（1） 叶绿体色素的提取 浸提法：称取0.2g新鲜叶片，剪碎，放入25 ml容量瓶中，加25ml80%丙酮遮光浸提10hr，浸提液备用。 研磨法：