免疫组化结果分析

1、免疫组化结果分析篇1：免疫组化（IHC）经验超全总结 做过病理实验的人都知道，实验看似容易，但真想把它做好，还是需要花上很长一段时 间去积累和摸索经验。我从事病理实验已有6年多了，在这段时间里，我做过许许多多病理 相关实验，刚开始啥也不懂，一味按照网上操作流程来做，但做的结果往往并不是十分理想, 最终结果未能达到预期的效果。经过一段时间的浏览和学习，在论坛内学习、请教，并结合 实践操作，我经历了初级一一查找资料和摸索方法；中级一一问题求助和不断总结：髙级一 难题解答和经验分享这三个阶段，也学到了不少知识，积累了很多宝贵经验，与大家一起 分享。 一、石蜡切片和冰冻切片的比较？ 要求做冰冻切片的不

2、一泄能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。因为作石蜡 切片时要髙温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳左，则可作石蜡切片： 但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。 冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这 一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散：切片厚度较石蜡的厚, 做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做 冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。 石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较 麻烦，一立要存在-80oC的低温冰箱中，尤其是

3、用来做原位杂交的切片，为了防止RNA降解, 保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到左右,所以原位杂交探针容易渗透到组织中去, 容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。 二、一抗的选择要点和技巧是什么？ 单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗 体能目标明确地与单一的特异抗原决左簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。列一方而， 即使是同一个抗原决左簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗 体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对 小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，

4、灵敏度髙， 但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。 应用范围的选择。有的一抗只能用于WB （Westernblotting）或免疫组化、免疫荧光、 免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。 种属反应性的选择。这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合 检测哪种种属动物体内的抗原。 种属来源，一般兔来源的多是多克隆：而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此 来源来选择相应的二抗。 生产厂家的选择。不同厂家的同一种抗体，它的实际效价稳泄是不同的，有的做免疫组 化效果较好，有的WB效果却更好一些。 三、在什么情况下使用Triton-XlOO? TritonX-100化学名称为

5、聚乙二醇辛基苯基联，是一种去污剂。在免疫组织化学（10 um 以上厚切片）和免疫细胞化学中一般用TritonX-100作为细胞通透剂，在膜上打孔。 其作用原理TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大 分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利 进入胞内与相应抗原结合。 TritonX-100既是一种表面活性剂，也有抗氧化作用。 四、封闭血淸的选择原则是什么？ 膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性。 封闭血淸一般是和二抗同一来源的，血淸中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反 应的位点发生结合

6、，否则在后而的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。 也可以用小牛血淸、BSA、羊血淸等，但不能与一抗来源一致。 五、抗体孵育条件的比较？ 一抗孵冇温度有几种4oC、室温、37oC,其中4oC效果最佳：孵冇时间这与温度、抗体 浓度有关，一般37oC, l-2h,而4oC过夜和从冰箱拿出后37oC复温45min。 二抗一般室温或37oC, 30min-lh,具体时间需要摸索。 六、一抗4C孵育后为什么要进行37C复温？ 一方面，防止切片从4oC直接放入PBS易脱片。 另一方而，使抗原抗体结合更稳左。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4oC 和37oC时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运

7、动速度小于后者，后者结合更快，但敏 感性也提高了井易造成非特异染色。 其实，我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4C过夜拿出后，直接用 PBS洗没发生过脱片现象。事实胜于雄辩。 七、DAB显色时间如何把握? DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲 洗。 DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓 度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短抗体孵冇时间。 若很短时间就出现背景很深，还有可能是你前而的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封 闭时间。 DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才岀现阳性染色，一方而可能

8、说明你的抗体浓度 过低或孵疗时间过短（最好一抗4oC过夜）；另一方面就是封闭时间过长。 八、免疫组化结果如何分析？ 阳性着色细胞讣数法。在40倍光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数 阳性着色细胞，每组3-6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。 灰密度分析法。通过在不同组別和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用 imagej进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。 评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0-3分为阴性着色、淡黄色、 浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1 -4分为0-25%. 26-50%、51-75%、76-100%）,最终 可以分数相加

9、，再进行比较。 对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着 色均匀、背景很注的高质量切片。 九、在什么情况下进行组织抗原修复，抗原修复的条件是什么？ 由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固左过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭 作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决左族重新疑露，提高抗原检测率。 修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干 种（具体的可以査阅相关资料，大量的中性的、髙pH的等）。 微波修复，我们一般用6min*4次，效果不错。 十、内源性过氧化物酶的火活时间和浓度是什么？ 一般3$过氧化氢灭活时间

10、短点，可以lOmin左右：而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭 时间，一般 10-30min。 用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS好在保护抗原和固左组织作用，过氧化氢孵冇时间 过长易引起脱片。 现用现配，配好后4oC避光保存。 十一、如何才能充分脱蜡？ 蜡不溶于水，如果脫蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起染色不均匀、阳性物时 隐时现、真假难辨、背景染色增加等。为了解决上述的问题，切片在染色前必须彻底脱蜡， 目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短： 脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜程度决泄。如果在夏天，室温较髙，脱蜡试 剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5min就已

11、足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较 陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20min或更长。 当天切的切片，烧烤2小时后进行染色，切片带有温度时进行脱蜡可加速脱蜡的过程， 如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温10-20min,然后再行脱蜡，这 样脱蜡速度加快，效果会更好。 总之，操作时应根据不同的季节，不同的室温，不同的试剂来决泄，脱蜡的时间，原则 上是要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡。 十二、如何最大限度地降低组织非特异性染色？ 缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条； 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议用单克隆抗体看看； 内源性过氧化物酶和生物素

12、在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通 过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色： 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血淸封闭时间和适当增 加浓度来加强封闭效果； 缩短DAB孵育时间或降低DAB浓度/过氧化氢浓度等： 适当增加PBS冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要； 防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色。 十三、苏木素复染时间的把握？ 苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的左位等情况，一般数秒-数分 钟。不过这个如果染色不理想可以补救的。即染色深则分化时间稍长些即可：染色浅则再置 于苏木素中染色即

13、可。 盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸洒精 中数秒（动作一泄要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。 如果分化的颜色过浅，可以复置于苏木素中染色。 十四、PBS的淸洗方式选择、次数和时间的选择？ 单独冲洗，防止交叉反应造成污染。 临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后， 将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行 冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。 温柔冲洗，防止切片的脱落。 冲洗切片，取出切片，将PBS从上轻轻地冲洗，让PBS自上而下流下来，不要拿起

14、切片 将PBS对准切片冲洗，这样由于冲出的PBS有一泄的冲击力，很容易使切片周边引起松动， 导致切片的脱落。 冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。 冲洗切片有人提出用微振荡器振染，振下未结合的各种物，使之不产生背景，此种做法 一是浪费时间，二是很容易导致切片的脱落。切片的冲洗据实践认为，用一小烧杯柔和地于 切片上冲洗，就能彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好于切片上再注入PBS, 持续2min左右就完全足够了。 PBS的pH和码子强度的使用和要求。 刘彦仿指岀中性及弱磴性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于 分解：低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高

15、离子强度则有利于分解。我们目前常用的 PBS的pH在4-6,浓度是0. 01M,根据本室十几年来的使用情况，认为该溶液价格便宜配制 方而，使用效果好。 常用试剂的配制和使用。 在免疫组织化学的染色过程中，用得最多的试剂就是缓冲液，因为切片在整个染色中， 抗体的加、换、切片的冲洗，DAB的配制都离不开缓冲液。可见缓冲液在整个染色中都起至 关键的作用，缓冲液的过酸或偏碱，都将影响染色的结果。 十五、脱片产生的原因和如何防止脱片？ 多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，后而补做第二批时用的病理科老师自己做 的片子，要好一点。 组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切得厚或者不均匀，或者切片

16、者手 法不好等。 组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。 没烤好，时间短温度不够之类。 操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢 吸水。 修复的问题抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进lOOoC的修复液时手法不好，咚 的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠掾酸容易脱片，但是你要用到 EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。 此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。 基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。 十六、背景染色较深的原因有哪些？

17、抗体浓度过髙一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对 苴工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即 用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。 抗体孵育时间过长或温度较髙解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带il时器， 及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很髙，要求一 抗孵冇的时间不是传统的lh,而是30min,因此，要根据染色结果进行调整。 DAB变质和显色时间太长DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB 不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离

18、出氧原子与DAB产生反应而 降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。 DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多 时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控， 避免显色时间过长。 组织变干修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流 失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAPPen在组 织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提髙操作速度。 切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24h）原因尚不淸楚，但现象存在。有

19、的 实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和 修复液的容器放在4oC冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天， 会岀现背景着色，因此，不可存放时间太长。 一抗变质、质量差的多克隆抗体注意抗体的有效期，过期的抗体要么不显色要么背景着 色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。 以上内容来自网络 ABGEXT抗体制备专家 20万余种在线产品任您挑选 左制服务为您打造专属抗体 免疫组化结果分析篇2:文读懂丨免疫组化步骤、结果分析及注意事项. 作者解螺旋科研大V团队 如需转载请注明来源解螺旋医生科研助手 导语 实验室花花师姐正在

20、教导新来的师弟“想拿高分文章，不学免疫组化怎么行？ ”免疫组 化王子毛博旁边插话“是这个理，今天我就豁出去，将我十多年的心得和经验奉献给小师弟 你了。”小师弟感激涕零，唯诺细听两位前辈的教诲 免疫组化，免疫组织化学技术（immunohistochemistry）,是一项利用抗原抗体反应，通 过使标记抗体的显色剂显色来确左组织细胞内抗原，对蛋白左位，左性的实验技术。 免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理切片和 组织芯片）和冰冻切片。石蜡切片，对组织形态保存好，保存时间也长，虽然对组织抗原集 爾有影响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制作方法。 免疫组

21、化步骤详解 免疫组化结果分析很多时候，我们千辛万苦地染岀了一张张漂亮的免疫组化片子。但是 却不知道如何正确地分析，得出理想的结果。这实在是一件憾事。如下图，正常的结果应该 是这样的镜下细胞核呈蓝色，阳性结果呈深浅不一的棕色。 结果分析主要有两种方法，阳性着色细胞计数法和评分法。前者是在40*光镜下，随机 10个视野下il数阳性着色细胞：后者则是在光学显微镜下按染色程度（0分阴性着色，1分 淡黄色，2分浅褐色，3分深褐色）和阳性范围（1分0-25%, 2分26-50%, 3分51-75%, 4 分76-100%）评分，最终分数相加。 免疫组化结果分析是毛博的特长，以下是他传授的独门绝技。 对照染

22、色 和做实验的时候必须设立对照组一样，免疫组化也必须设立对照染色。没有对照染色的 免疫组化结果是不可信的。对照一般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身 对照。一般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照就足够了。 定位 抗原表达必须在特定部位。如LCA应立位在细胞膜上；CK应左位在细胞浆内：PCNA及 P53蛋白应左位在细胞核内等等。不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结果。 有可能是非特异性染色或者假阳性。不能确立怎么办？这就要用到上一段提到的对照染色了。 半泄位 现在一般用图像分析系统进行泄量。如果你的实验室不幸没有那么高大上的话，就只好 赶鸭子上架，用肉眼左一下量

23、了。因为人为主观性比较强，所以只能称作半泄量。免疫组化 的半泄量一般就分为三级弱（ +）,中（卄），强（+）。以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿 色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。弱（+）二1,中（+）二2,强（+）二3。至少随 机观察5-10个HPF。然后根据（+ ） % x 1 + （+） % x 2 + （+） % x 3计算出数值；总数 值5者为（+）。 图像分析仪 如果要进行精确圧量的话，就要用到图像分析仪。图像分析仪类型很多。这里就不一一 介绍了。英实毛博最想隆重推荐的是一款图像分析软件Image J。毛博当年在米国做博上猴 的时候，就是用的这款软件。这是NIH开发的免费软件。一

24、般的免疫组化结果分析用它就绰 绰有余了。现在已经开发到了 50版。网上可以免费下载。苴界面非常简洁，如下图所示。 现在，根据一个实例来看看如何用Image J来进行图像分析。如下图所示，我们有一张 细胞的免疫荧光染色的照片。那么，如何用Image J来计数细胞的个数呢？ 首先，要把彩色的图像转换成黑白图像。步骤如下Image-Type-16-bit。转换成黑白 图像后，将要讣数的部分用髙亮标示出来。步骤如下Image-Adjust Threshold。然后拖动 鼠标，直到所有的细胞被标示出来。 有时候2个细胞靠得比较紧密，会被计数为1个细胞。这个时候可以采用I mage J的水 洗功能步骤如下

25、Image-Binary-Watershed。如下图的蓝色箭头所示，这些是本来计数成 一个的细胞，经过水洗之后，更加精确地被计数成了 2个细胞。 然后,就可以正式开始分析了。步骤如I Analyze-*Analyze Particles 免疫组化结果分析篇2:对照染色 免疫组化结果分析篇2: 免疫组化结果分析篇2:定位 免疫组化结果分析篇2:半左位 免疫组化结果分析篇2: 免疫组化结果分析篇2:图像分析仪 免疫组化结果分析篇3:病理报告中免疫组化的结果你了解多少？ 来源走进tumor 免疫组化不仅可以反应肿瘤的病理类型，也能反应肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。 肿瘤免疫组化耐药预后标记,4项P-g

26、p、GST T0P0IK Ki-67o 下面免疫组化指标的意义 P-gp（P-糖蛋白） 高表达则对下列耐药强阿签素类、柔红霉素、米托恿:醍、长春碱类、紫杉醇类。 GSTn （谷光甘肽S转移酶） 高表达则对下列耐药强阿霊素、顺钳、氮芥、环磷酰胺。 TOPOII （拓扑异构酶II） 高表达则对下列敏感恿环类抗生素和鬼臼毒素类，如VP-16.替尼泊昔、柔红靈素、阿 霉素类、VM26o ER （雌激素受体）、PR （孕激素受体） 高表达则对内分泌治疗敏感，预后越佳。 HER2 基因（C-erbB-2） 高表达则肿瘤恶性程度髙。ER、PR、C-erbB-2都阳性者，三苯氧胺疗效差。 Ki-67 细胞增殖

27、的标志，髙表达则肿瘤增殖快，恶性程度高。 CEA 多数腺癌表达CEAO Nm23基因 转移抑制基因，其阳性表达和肿瘤转移呈负相关：Nm23蛋白高表达患者淋巴结转移率相 对较低，存活期相对较长。 Rb （视网膜母细胞瘤）基因 抑癌基因，调节细胞周期。 E-Ca （钙粘附蛋白） 介导细胞间粘连作用的跨膜糖蛋白，其功能丧失引起细胞之间连接的破坏，主要用于肿 瘤侵袭和转移方面的研究。 PS2 （雌激素调节蛋白） 可作为内分泌治疗和预后判断的指标之一。 CK18 （低分子量角蛋白） 标记各种单层上皮包括腺上皮，而复层鳞状上皮常阴性，用于腺癌诊断。 CK19 （细胞忖架蛋白） 分布于单层上皮和间皮，常用于

28、腺癌诊断，肝癌不表达、胆管癌为阳性。 Hep pari （肝细胞抗原1） 正常肝细胞和高分化肝细胞癌阳性，低分化肝细胞癌多弱阳性或阴性。 CK7 （细胞角蛋白） 卵巢、肺和乳腺上皮常阳性，结肠、前列腺、胃肠道上皮阴性。 CK20 （重组人细胞角蛋白） 胃肠道腺癌、卵巢黏液性肿瘤、皮肤Merkel细胞癌诊断;鳞癌、乳腺癌、肺癌、子宫内 膜和卵巢非黏液性肿瘤常阴性。 MRP1 （多药耐药相关蛋白1） 影响化疗敏感性，和预后相关。 TS （胸昔合成閒） 5-FU重要作用靶点，如果其高表达，阳性反应+以上，提示肿瘤细胞对5-FU耐药。 Syn （突触素） 神经组织标志。 S-100 神经组织标志，存在

29、于神经组织，垂体、颈动脉体，肾上腺髓质、唾液腺、少数间叶组 织，常用于神经鞘瘤、恶黑、脂肪肉瘤、软骨肿瘤诊断。 NSE （神经元特异性烯醇化酶） 主要用于神经内分泌肿瘤诊断。 Chr （嗜路素） 肾上腺髄质含量很高，可用于鉴别肾上腺髓质和皮质，用于神经内分泌肿瘤诊断。 CKH （髙分子角蛋白） 标记鳞状细胞肿瘤。 CKL （低分子角蛋白） 标记单层上皮、腺上皮。 EMA （上皮膜抗原） 糖蛋白，广泛分布各种上皮及其肿瘤。 P504 （甲酰基辅酶A） 消旋酶检测诊断前列腺癌的敏感性为9砒，特异性为100%o CD117 （酪氨激酶受体） 诊断胃肠间质瘤。 CD10 共同急性淋巴母细胞型白血病抗原，主要表达于未成熟淋巴细胞，B