[精品论文]菌根菌侵染 lept4 突变体和野生型番茄对砷吸收和响

1、菌根菌侵染 lept4 突变体和野生型番茄对砷吸收和响应差异的比较1王萍，陈爱群，顾冕，胡江，孙淑斌，徐国华南京农业大学资环院植物营养系，南京 (210095)e-mail：摘要：通过 glomus intraradices 菌根侵染番茄 lept4（菌根特异性诱导表达的磷酸盐转运 基因）突变体(lept4)和其 micro-tom 野生型(wt)对磷和砷的吸收和响应差异的比较发现，在没有砷处理情况下，lept4 突变极其显著地降低了番茄从菌丝体获取磷素的能力和菌根菌侵染对番茄生长的改善。0.05 mm 外源砷的添加显著降低了菌根菌对于 lept4 突变体植株根部

2、 的侵染，而对野生型材料侵染率的影响无显著差异。添加外源砷没有显著影响两个受菌根特异性调控表达的番茄磷酸盐转运蛋白基因 lept4 和 lept5 的表达。但相对于野生型，无论 是相对生长量还是砷的吸收，lept4 突变均不能增强对 0.05 mm 外源砷的抗性。接种菌根菌的植株地上部和地下部的砷累积均极显著降低。无论有没有菌根菌的侵染，lept4 的突变 均不影响番茄对砷的吸收和转运，因此，在番茄植株中砷的吸收和转运可能有不同的途径。关键词：番茄；砷；菌根菌；突变体；磷酸盐转运蛋白基因 中图分类号：q9351. 引言植物体通过一系列改变根际环境的方式来吸收的无机态磷素营养，这些磷通过根系细胞

3、 膜进入植物体是由同一或不同家族的多个磷转运蛋白基因来实现的。依据转运时介质中有效 磷浓度的高低，编码磷素转运蛋白基因可以粗分为km值在 mm 范围内的低亲合力磷酸盐转 运系统（low-affinity）和km值在 m范围内的高亲合力磷酸盐转运系统（high-affinity）两 大类（muchhal 等，1996）。磷和砷元素都是位于元素周期表中的第五主族，相似的电子层结构使得它们在物理和化 学性质上也有类似。已经有许多研究表明，由于砷和磷的这种相似性，使得砷及其化合物很 容易就会通过植物细胞膜上高亲和的磷素转运蛋白进入到体内，同时植物体对砷具有更高的 敏感性（meharg 等，1990，1

4、991b，1992b和2002；bleeker等，2003）。目前在番茄植株体内发现的磷酸盐转运蛋白基因主要有五个，它们分别是缺磷增强表达 的lept1和lept2基因，菌根诱导增强表达的lept3基因，以及由菌根专性诱导表达的lept4 和lept5基因（liu 等，1998a；nagy 等，2005；chen 等，2007；xu 等，2007）。我们以一个菌根专性诱导表达的番茄磷酸盐转运蛋白基因lept4的突变体（lept4）及其野生型为材 料，研究了它们在对砷的吸收及其他一系列生理响应上的差异，以及外源砷对于二者体内各 磷酸盐转运蛋白基因表达的影响，从而揭示各磷酸盐转运蛋白在砷的吸收上的

5、功能和意义，为将以磷酸盐转运蛋白基因用在砷污染的环境修复上的设想提供了理论研究基础。1 本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金 用双向遗传学途径结合研究影响番茄利用无机磷效率的 分子生物学基础, 项目批准号：20040307037; 国家自然科学基金项目 用反向遗传学途径研究番茄磷素运 输蛋白的生理功能 项目批准号：30471037; 江苏省自然科学基金 植物磷酸盐转运体 pht1 家族基因的功 能及其表达调控分析, 编号：bk2005089 的资助。2. 材料方法2.1 试验材料番茄（solanum lycopersicum l.）品种为微型番茄 micro-tom（wt）和它的一个菌根专

6、 性诱导表达的磷酸盐转运蛋白基因 lept4 缺失突变的突变体材料（lept4）（xu 等，2007）。 试验所用菌根菌为 glomus intraradices，由中科院南京土壤研究所林先贵教授课题组提2.2 试验设计番茄生长在人工温室进行，生长条件：光周期白天 14 h，温度为 28，光强 100200wm-2； 晚上 10 h，温度为 16 。野生型（wt）和突变体（lept4）的种子分别经 10h2o2 消毒 30min 后置于恒温气候培 养箱（14h/10h，30/20）。出芽后移置蛭石中，小苗展开两片真叶后，除磷素用 0.25mm nah2po4 外，其它用 1/4 全营养液培养

7、10d，移栽于盆钵中进行砂培 am 菌根菌侵染试验。 除了磷 素营 养外， 其它 营养元 素浓 度为： 2mmoll-1kno3 ， 1mmoll-1nh4no3 ，0.5mmoll-1ca(no3)2,0.25mmoll-1cacl2,0.5mmoll-1mgso4,20moll-1fe-edta,9moll-1m ncl2，46moll-1h3bo3，0.8 mmoll-1znso4，0.3moll-1cuso4，0.3moll-1(nh4)2moo4， pi 素营养用 nah2po4，其浓度为 0.05mmol/l（低浓度的磷素营养更有利于菌根菌对对番茄 根部的侵染），ph 调至 5.5

8、 左右。砂培试验：试验前将洗净的黄砂 170干热完全灭菌（不低于两小时），冷却后装盆， 每盆 2kg 黄砂，盆下垫纱网和一托盘。每 100g 黄砂可持水 21.7ml（从上面浇水至托盘中刚 流出水时计）。试验设 4 个处理，分别为：野生型菌剂（wtm），野生型灭活菌剂（wtm），突变体菌剂（lept4m），突变体灭活菌剂（lept4m），各处理重复10 盆，每盆种 2 株，每棵苗的根部接种 3g 菌剂。试验过程中每 3-4 天按不同的磷处理浇灌 一次营养液，培养 20 天后每周进行检测，待发现菌根菌有一致侵染后进行砷处理，即在营 养液中加上不同浓度的砷酸盐(na3aso412h2o)，砷浓度设

9、为 0.05mmol.l-1（砷浓度参照以 前的菌根侵染砂培试验而确定），每 3 天浇灌一次营养液，处理 4 周后采样进行生理分析测 定，并采各处理的根系和叶片样，液氮冻存后贮于-70冰箱，待 rna 提取用。2.3 主要试剂trizol reagent、逆转录试剂盒、dnase 均购自 invitrogen 公司，pcr 试剂购自南京生 兴生物有限公司, 引物由上海博亚生物技术有限公司合成, 其他各种化学试剂均为进口或国 产分析纯。2.4 测定方法2.4.1 生物量 将每株番茄植株分别从河砂中取出（注意不要伤根）。为避免根表的砷残留，参照 liao（2003）的方法，根系自来水冲洗干净后，用

10、剪刀将根系和地上部分开，再用超纯水清洗。吸水纸吸干表面水分后，分别称鲜重。样品经 105杀青 30min 后，70烘干 72h 称重（精 确至 0.0001g）。2.4.2 植株全磷含量称取烘干的粉碎植株干样 0.1g（精确至 0.0001g）左右，置于 100ml 消化管中，通过 h2so4-h2o2 高温消煮后，采用钼锑抗比色法（鲍士旦，2000），722 型分光光度计，700nm 波长下比色，分别测定植株地上部和地下部的全磷含量。2.4.3 植株砷含量 采用氢化物发生原子荧光光谱法（李贵峰，1999）。称取烘干的粉碎植株干样 0.1（精确至 0.0001g）左右，置于高脚烧杯中，通过 h

11、no3-hclo4（4：1 v/v）在不高于 180下消煮后，采用 af-600（北京瑞利）系列原子荧光光谱仪分析法分别测定地上部和地下部的砷 含量，测定参数按照仪器说明书。试验中的砷标准物质编号为 gbw07604。2.4.4 菌根侵染率采用 mcgonigle（1990）和 david（2001）的菌根侵染检测计算的方法。取 0.2-0.5g 新 鲜的根，剪成 1cm 左右的根段后，装入根盒中，先置于 10的氢氧化钾溶液中，在 90水 浴中加热 30min 之后，将碱液倒掉，用自来水冲洗 3 次，再加 2的盐酸溶液浸泡 5min。 将盐酸溶液倒掉，直接加 0.5的染料（trypan blu

12、e：400ml 85乳酸，chlorazole black e：1.2g，蒸馏水：400ml）溶液，在 90的水浴加热 30min。将染色液倒掉，仍用自来水冲洗3 次后，直接将根段至于带有等间距方格的 9cm 培养皿，加入适量的蒸馏水后，在显微镜（leica，dmr，germany）下观测，利用网格交叉法来算出侵染率。 侵染率的计算公式：侵染率（）被侵染的根段数100/总根段数2.4.5 组织总 rna 制备取冻存样品 100mg, 液氮匀浆后加入 trizol 试剂 1ml, 加入 0.2ml 氯仿, 离心后吸取上 清液, 加入 0.5ml 异丙醇, 离心沉淀后弃上清液, 再用 70乙醇洗沉

13、淀, 用 dnasei 酶解可能 残余的基因组 dna。rna 溶于 1depc 水, 用凝胶电泳法和分光光度计法检测其浓度和 纯度。2.4.6 cdna 合成每个总 rna 样品取 2 g，加入 50 mol l-1 oligo (dt18)，加无 rnase 水补足 10 l，70下水浴 5 min，室温放置 5 min 后，依次加入 rnase inhibitor 0.5l，5rt buffer 5l，5 mmol l-1 dntp 2.5 l，m-mlv 反转录酶 1 l，无 rnase 水补足 25 l，42水浴 60 min 后，70水浴 10 min 以中止反应。2.4.7 pc

14、r 反应在 ncbi(/)网站搜索，获得番茄的 5 个番茄的磷酸盐转运蛋 白基因 mrna 序列，按照各基因的碱基序列来设计引物进行 pcr 扩增，来检验和分析这些 磷酸盐转运蛋白基因在有外源砷的影响下的半定量表达模式，基因的序列号，引物序列以及 产物长度和退火温度如表 1。基因序列号表 1 基因序列号和所设计的引物序列table 1 gene accession number and primer sequences退火温度产物长度名称accession引物序列 primer sequence (5-3)annealingproduct l

15、engthgenenameno. temperature ()（bp）lept1af022873f：tgaacagcataccgagga r：gggtggcttggagataaalept2af022874f：gcattgatacagcctagaac r：ggtgattaccctttgtcclept3ay804011f：gattgagcagcatacaga r：tgataataagccagggatlept4ay804012f：acagagtagcgaatgtcc r：ggtatagtgcgaaaggtglept5ay885653f：gcggattatgtcgtggcggat r：ctgtgtga

16、gattttggctgtagaaactinu60481f：ttccgttgcccagaggtcct r：tcgccctttgaaatccacatc571237581055541215588645332252321pcr 反应体系为 20 l，包含 10 pmoll-1 正反向引物各 1 l，10pcr buffer 2 l，2.5mmoll-1 dntp 1.6 l，taq 酶 0.4 l，模板使用量因其浓度不同而不同，并通过看家基因（actin）来校正其用量，最终以灭菌水补足 20 l。pcr 反应的条件是 95c 预变性 2 min， 然后 94c 变性 15 s，53c 或 57退火 2

17、0 s，72 c 延伸 30 s 或 1min，进行 30 次循环，最 后 72c 充分延伸 10 min。扩增的 pcr 产物通过 1%或 1.5%的琼脂糖胶电泳，通过溴化乙淀（eb）染色后，在凝胶成像系统扫描成像。2.5 数据处理数据统计利用 sas9.0 软件进行方差分析和 fishers 显著性检验(lsd)，比较不同处理间 在 p0.01 的显著性水平。3. 结果与分析3.1 外源砷对 wt 和 lept4 菌根菌侵染率的影响图 1 glomus intraradices 菌根菌对于番茄根部侵染及对照的图片(移栽后 50 天)fig. 1 photos of tomato roots

18、 infected by glomus intraradices (50 days after transplanting)菌根菌（glomus intraradices）对试验各处理的根系的侵染情况如图 1 所示，无论有无 外源砷的添加，wt 和 lept4 突变体在接种灭活菌剂均未检测到被侵染（ck-接种灭活菌剂的 对照组），番茄植株根染色后呈现明显的清亮透明，其它各处理均能明显地观测到孢囊和丛 枝菌丝。以观测到被菌根菌（glomus intraradices）侵染的根系的数量，统计其侵染率如图 2 所 示，对于野生型 wt 番茄植株，0.05mmoll-1 外源砷加入时侵染率有所降低，但

19、与无外源砷 存在时无显著差异，均在 70左右，表明 0.05mmoll-1 的砷并不影响菌根菌对于野生型根 系的侵染率，这和以前结果是相同的；对于 lept4 的突变体植株来说，0.05mmol l-1 外源砷 的存在显著降低了菌根菌的侵染率。从图中还可以发现，野生型和突变体之间在没有外源砷 存在的环境中，菌根菌对二者根部的侵染率无显著差异，而在有 0.05mmoll-1 外源砷存在时， 突变体 lept4 的侵染率显著显著低于野生型的侵染率。因此，在添加外源砷和 lept4 突变的 同时菌根菌侵染番茄根系的能力显著地降低。80% aa70%60%wt lept4ab50%40%根的侵染率ro

20、ot infection30%20%10%0%-as +as不同的处理组 different treatments图 2 外源砷对接种glomus intraradices菌根菌的wt及lept4番茄根部的侵染率的影响fig. 2 influences on the roots infection by glomus intraradices with external arsenate3.2 外源砷对 wt 和 lept4 番茄植株生物量的影响各处理的番茄植株生长状况（生物量鲜重）如图3 所示。无论有无外源砷存在，wt和 lept4二者的生物量均为接种glomus intraradices菌

21、根菌的处理组显著高于接种灭活菌剂的处 理组，与以前结果相同，菌根菌的侵染明显改善了番茄植株的生长状况。对于接种glomus intraradices野生型wt番茄植株，无外源砷添加时的生物量极显著高于 有0.05mmoll-1外源砷存在的处理组；接种灭活菌剂的野生型植株，无论有无外源砷添加， 其生物量均无显著差异。对于接种glomus intraradicess和接种灭活菌剂处理的突变体lept4番 茄植株， 0.05mmol l-1外源砷的存在与否对植株的生物量无显著影响。0.05mmol l-1外源砷 对菌根菌glomus intraradices侵染的的野生型番茄植株生长影响较大，而对突

22、变体的影响无 差异。接种glomus intraradices菌根菌无外源砷的处理组中，野生型和突变体的生物量之间达 到了极显著差异；有0.05mmol l-1外源砷存在的接种菌根菌组中，突变体和野生型的生物量 无差异。在未接种菌根菌的情况下，有0.05mmol l-1外源砷存在和无外源砷存在的处理组中， 突变体植株的生物量均显著高于野生型。16.00a14.00植株鲜重(g.plant-1) total fresh biomass12.00bbb10.008.00wt lept4cc dd6.004.002.000.00+m-as+m+as-m-as-m+as不同的处理组 different

23、 treatments图 3 外源砷对接种和未接种glomus intraradices wt及lept4番茄植株生物量的影响fig. 3 influences on biomass infected or not by glomus intraradices with external arsenate3.3 外源砷对 wt 和 lept4 番茄植株磷浓度的影响图4分别表示有无外源砷时，菌根菌（glomus intraradices）对野生型wt和lept4突变体 番茄植株地上部（图4a）和地下部(图4b)的磷浓度的影响。无论有无0.05mmol l-1的外源砷 存在，接种glomus in

24、traradices番茄植株地上部的磷浓度均极显著高于接种灭活菌剂的处理 组（图4a）。番茄植株地下部磷浓度在所有处理组中都无显著差异(图4b)。接种glomus intraradices的野生型wt番茄植株，0.05mmol l-1的微量外源砷的添加显著 抑制了地上部的磷浓度；接种灭活菌剂的野生型植株，无论有无外源砷添加，地上部的磷浓 度均无显著差异。接种glomus intraradicess的处理， 0.05mmol l-1外源砷存在与否均对植株 地上部的磷浓度无显著影响；接种灭活菌剂处理的突变体lept4番茄植株，0.05mmol l-1的微 量外源砷的添加显著抑制了地上部的磷浓度。野

25、生型wt和突变体lept4在相同处理组中，其地上部的磷浓度，除在接种菌根菌并且不 存在外源砷和接种灭活菌剂有0.05mmol l-1的外源砷的添加的情况下有显著差异外，其它各 处理组间均无差异。由图4b还可以看出，0.05mmol l-1外源砷、glomus intraradices菌根菌的 侵染对野生型wt和突变体lept4的番茄植株地下部的磷浓度都无显著影响，二者地下部的磷 浓度均在0.39-0.46之间。5.004.50a地上部磷浓度(g.kg-1)shoot p concentration4.00b3.503.002.502.001.501.000.500.00awtlept4bbcc

26、cd+m-as+m+as-m-as-m+as不同的处理组 different treatments6.00bwtlept4地下部磷浓度(g.kg-1)root p concentration5.004.003.002.001.000.00+m-as+m+as-m-as-m+as不同的处理组 different treatments图 4 外源砷对接种和未接种glomus intraradices wt及lept4番茄地上部（a）和地下部（b）磷含量的影响fig. 4 influences on shoo（ta）and roo（tb）phosphate concentration infecte

27、d or not by glomus intraradices with external arsenate3.4 菌根菌对 wt 和 lept4 番茄植株砷浓度的影响从接种glomus intraradices和接种灭活菌剂的野生型wt和突变体lept4番茄植株体内地 上部（图5a）和地下部（图5b）的砷浓度可以看出，番茄植株对于外源砷的吸收累积主要 是集中在地下部，这和以前结果是相同的，也是和其他大多数植物对于砷的吸收和累积特点及耐性研究是相似的（asher等，1979；marin等，1992；carbonellbarrachina等，1999；tu等，2002和2003）。接种glomu

28、s intraradices和接种灭活菌剂的野生型wt和突变体lept4番茄植株体内地上 部和地下部在砷的浓度变化上呈现相同的趋势。无论是突变体还是野生型，接种灭活菌剂处 理组植株地上部和地下部的砷含量均高于接种菌根菌的处理组，并且呈现极显著差异，菌根 菌的侵染使得番茄植株降低了对于外源砷的吸收。无论是接种菌根菌还是接种灭活菌根菌的 番茄植株，突变体lept4地上部和地下部的砷含量均显著低于野生型体内的砷含量，降幅在15-34之间，在接种菌根菌的处理组中这种降幅尤其显著。6.00 a地上部砷浓度(mg.kg-1) shoot as concentration5.00 ab b4.003.00

29、c2.001.000.00wt+m wt-m lept4+mlept4-m 不同的处理组different treatmentsb90 a80b-170605040 c30 d地下部砷浓度(mg.kg ）root as concentration20100wt+m wt-m lept4+mlept4-m 不同的处理组different treatments图 5 外源砷对接种和未接种glomus intraradices wt及lept4番茄地上部（a）和地下部（b）砷浓度的影响fig. 5 influences on shoot（a）and root（b）arsenate concentra

30、tion infected or not by glomus intraradices with external arsenate3.5 lept4 磷酸盐转运蛋白基因对番茄磷砷累积的影响我们还分析了glomus intraradices菌根菌、0.05mmol l-1的微量外源砷的添加对野生型 wt和突变体lept4番茄植株体总磷和砷的累积量的影响及它们的各自变化率（表2）。由表1 可以看出，wt和突变体lept4的番茄植株在有0.05mmol l-1外源砷和没有外源砷的处理组中， 菌根菌的侵染均显著地增加了植株体对磷的累积量。无论有无外源砷的添加，wt植株内磷 的累积在菌根侵染后的增长率

31、均远远大于突变体lept4被菌根侵染后植株体内磷的增长率，这 种现象在无外源砷添加的处理下表现尤为明显，这说明了菌根专性诱导的磷酸盐转运蛋白基 因lept4对于番茄植株体对磷的吸收和累积有着异常重要的作用，推测该基因主要担负着菌 丝体内的磷向植株体内运输的功能（xu 等，2007）。相反，正是由于菌根菌的侵染，wt 和lept4番茄植株体内的砷累积量均显著降低，菌根菌对于番茄砷的吸收和累积起到了屏障的 作用。从菌根菌侵染的突变体lept4和wt植株体内砷的累积量的变化率来看，二者之间基本 无差异，番茄体内磷酸盐转运蛋白基因lept4的突变对于砷的吸收和累积无影响。表2 菌根和外源砷对wt和le

32、pt4总磷砷吸收的影响table 2 the effect of mycorihiza and external arsenate on total phosphate and arsenate accumulated by wt andlept4-as+asg p/plantg p/plantug as/plantwtlept4wtlept4wtlept4myc1.972.621.852.0512.76*11.16*myc5.58*3.76*3.49*3.09*7.515.8变化率（）183448951-41-48*表示p0.01的显著性差异，*表示p0.05的显著性差异注。-as表示无外源

33、砷添加处理组；as表示有0.05mmol l-1外源砷添加处理组；-myc表示接种灭活菌根菌处理组；myc表示接种菌根菌处理组；变化率（）(myc)-(myc) /(myc)*100 3.6 菌根和砷对 wt 和 lept4 磷酸盐转运蛋白基因表达模式的影响如前所述，在番茄体内克隆并获得的磷酸盐转运蛋白基因有五个，它们分别是lept1， lept2，lept3，lept4和lept5。图6表示的是野生型wt和突变体lept4中以上5个磷酸盐转 运蛋白基因的表达情况。从野生型中的表达模式看，lept1，lept2和lept3这3个基因是都 是受缺磷诱导增强表达的，但lept1在地上部和地下部都受

34、缺磷增强表达，而lept2只在根 部表达。在菌根菌侵染的情况下，野生型中lept2在根部的表达会有所减弱，相反lept3在 根部会增强表达，而在地上部反而有所下降。lept4和lept5是在菌根菌侵染的番茄植株根 部特异性表达的磷酸盐转运蛋白基因（图6），这些结果与先前报道的基本一致（liu 等，1998a；nagy 等，2005；chen 等，2007；xu 等，2007）。图 6 有无外源砷存在下接种和不接种菌根菌的野生型和突变体番茄磷酸盐转运蛋白基因的表达模式fig. 6 expression pattern of phosphate transporter genes in respo

35、nse to mycorrhizal with or without external arsenate由图6可以看出，wt地上部lept1基因在接种glomus intraradices的处理下表达明显弱于 不接种菌根菌的处理组，而lept4突变体地上部lept1基因的表达则不会由于接种菌根菌发生 变化。wt地下部lept1基因的表达不会随着菌根菌的侵染而发生变化，lept4突变体地下部 的lept1基因的表达则会由于菌根菌的侵染而减弱表达。两种基因型的地上部和地下部 lept1基因的表达都不会因0.05mmoll-1外源砷的存在而有所变化。wt和lept4突变体植株地上部的lept2基因表

36、现出相同的变化趋势，接种菌根菌的植株 的表达显著减弱；随着0.05mmoll-1外源砷的加入，野生型地上部lept2基因的表达有所减 弱，而突变体植株地上部lept2的表达却呈现增加的模式。而地下部lept2的表达模式，与 野生型几乎无差异。突变体植株在接种菌根菌时，有无外源砷其lept2的表达状况都相同， 而接种灭活菌根菌时，加砷的处理的表达显著减弱。野生型和突变体lept3的表达模式的差异较明显，对于野生型植株地上部lept3的表达 在接种菌根菌时显著降低，并且不会随着外源砷的存在而改变表达模式；而在突变体植株地 上部接种菌根菌处理组lept3的表达则显著增强，并且表现出0.05mmol

37、l-1外源砷的加入增 强其表达的现象。野生型植株地下部lept3的表达在接种菌根菌的处理组中显著增强，0.05mmoll-1外源砷的加入减弱了它的表达，而突变体植株地下部lept3的表达并不会由于菌根菌的侵染而发生变化，但是0.05mmol l-1外源砷的存在显著降低了它的表达。lept4 和 lept5 基因 仅在 接种菌 根菌 的番茄 植株 根部有 表达 ，它们 均不 会因为 0.05mmoll-1外源砷的存在而发生表达模式的改变。4. 结论与讨论本实验研究表明，相对于野生型 wt 的番茄植株，菌根诱导根部特异性表达的一个磷酸 盐转运蛋白基因 lept4 缺失突变的突变体番茄植株并没有表出

38、对 0.05mmol l-1 的外源砷具 有更好的抗性。半定量 pcr 的研究结果也表明，在接种了菌根菌的野生型 wt 番茄植株中0.05mmol l-1 的外源砷的添加也并没有影响 lept4 基因本身的表达，这就意味着番茄植株体 内磷酸盐转运蛋白基因 lept4 并不参与或者影响植株在菌根感染的情况下对于砷的吸收和代 谢。有很多的研究表明，由于砷和磷二者之间的相似性，使得植物体对砷具有更高的敏感性， 因此砷就很容易就会通过高亲和的磷素转运蛋白通过细胞而进入到植物体内（meharg 等，1990，1991b 和 1992b），而这种高亲和的磷素转运蛋白是受磷饥饿诱导增强表达的，因此植株体对于

39、砷的吸收主要就和土壤中可被吸收利用的磷有着密切的关系（bleeker 等，2003； raghothama 等，1999）。拟南芥的高亲和磷转运蛋白突变体 pht1;1 和 pht1;4 表现出对五 价砷的抗性（shin 等，2004），说明这两个磷转运蛋白在对于砷的吸收上扮演了重要的角 色。还有研究表明，一种藻类的控制磷酸盐转运蛋白生成的元件基因的突变体 phf1 也表现 出了对砷的强烈的抗性（gonzalez 等，2005）。前人的研究还表明许多植株对于砷的抗性增 强都是通过抑制高亲和的磷素吸收系统来减少对于砷的吸收来实现的（meharg 等，2002）。从本文的结论来看，lept4 的缺

40、失突变则并不会导致植株对砷具有更好的抗性，磷酸盐 转运蛋白基因 lept4 对于番茄植株吸收和累积砷没有影响。我们的研究结果表明（表 1， lept4 对于番茄植株体吸收和累积磷素营养尤其重要正是由于该基因的突变，植株体对于磷 的累积量的增加率极其显著降低，推测该基因主要担负着将菌丝体内的磷向番茄植株运输的 重要作用，但却对于体内砷的吸收累积的变化率无差异。从番茄植株体内磷酸盐转运蛋白基 因的表达图谱（图 6）来看，有无外源砷的添加，由菌根专性诱导表达的磷酸盐转运蛋白基 因 lept4 的表达量均没有任何变化，这也正说明了番茄植株对于砷的吸收与磷酸盐转运蛋 白基因 lept4 可能是没有关联的

41、，此时番茄对于砷的吸收可能有其他的途径。我们知道， 无论是对于土壤中生存的植株，砷都是有毒的元素，在植株体内仅仅会破坏体内的正常生理 代谢，因此植株不会形成单独的砷的吸收转运蛋白基因而用来运输自然界中的砷进入体内， 因此，砷必然就是通过一种捷径来进入植株体内，这便是我们一直强调的其以五价砷的形式 通过磷酸盐转运蛋白来“悄悄”进入植株体内，对于植株体本身来说这是一种漫长的进化过 程。对于现在砷的污染不是太严重和普遍的状况下，那些它们本身所具有磷酸盐转运蛋白基 因对于砷的吸收已经是足够并且有余，植物并不需要再去用很长的时间进化一个或者是多个 磷酸盐转运蛋白基因来参与砷的吸收和体内的运输。本文的研究

42、表明，一个受菌根菌特性诱导表达的磷酸盐转运蛋白基因的缺失虽然不会增 强其对外源砷的抗性，但是无论是野生型还是突变体植株，接种菌根菌的植株无论是地上部 还是地下部的砷的含量都是极显著降低，特别是 lept4 突变体材料的地下部砷含量。gonzalez 等（2002）的研究就首次表明，一种植物 holcus lanatus 被菌根菌侵染后，无论侵染率的高 低，均通过降低对于砷的吸收而表现出砷抗性的增强，菌根菌的外源砷污染环境中的植株起 着保护屏障的作用。推测可能是由于菌根菌侵染的植株增加了植株对于磷素营养的吸收和利用，而根据王等 2007 的研究结果，提高供磷能够减少番茄植株对砷的吸收，缓解外源砷

43、对于番茄的毒害（王萍等，2007）。从本文的研究来看，菌根菌对于野生型和突变体的植株的侵染有所不同，尤其是0.05mmoll-1 砷的存在对于突变体材料的侵染率的影响较大，显著降低了菌根菌对于植株根 部的侵染，而对野生型材料侵染率的影响无显著差异。以前的试验中，我们发现只有当砷的 浓度达到较高的程度才会影响菌根菌的侵染率，然而在砷浓度很低的情况下，0.05mmoll-1 微量砷在某种程度上抑制了与突变体 lept4 的菌根侵染率，关于这一点，我们还有待进一步 试验来研究。从各磷酸盐转运蛋白基因的表达图谱来看，菌根侵染率的高低并不会影响 lept4 以及 lept5 的表达量。砷是以五价的形式进

44、入植株体内的，并且五价的砷一旦进入体内细胞内就会被还原成三 价的砷，三价的砷很容易和巯基结合进入液泡而对植物体产生更强的毒性（pickering 等，2000）。具有砷抗性机制的植物体主要是通过抑制砷的吸收来实现的，事实上，五价砷的毒 性主要是由于它和磷之间的结构相似行，使得砷很容易就能通过植物细胞上高亲和的磷转运系统而引起的。但是本文的研究结果发现 lept4 这个基因在砷的吸收和运输上并无特殊功 能和作用。然而其他番茄植株体内的磷酸盐转运蛋白基因在砷吸收上的功能和作用，还有待 通过分子生物学的一系列方法去研究，为砷污染的土壤的修复作出更大的贡献。参考文献1 asher c.j. and p

45、.f. reay., chemical distribution and gaseous evolution of arsenic-74 added to soils asdsma-74as. plant physiology, 1979, 6:459-4662 bleeker, p.m., schat, h., vooijs, r., verkleij, j.a.c., and ernst, w.h.o. mechanisms of arsenate tolerance incytisus striatus. new phytol. 2003, 157: 33-383 carbonellba

46、rrachina a a, burlo f, lopez e, martinez-sanchez f. arsenic toxicity and accumulation in radishas affected by arsenic chemical speciation. j environ sci heal. part b 1999, 34:661-6794 chen a q, hu j, sun s b, xu g h. conservation and divergence of both phosphate- and mycorrhiza-regulated physiologic

47、al responses and expression patterns of phosphate transporter in solanaceous species. new phytologist., 2007, 173:817-8315 david-schwartz, r., badani, h., smadar, w., levy, a.a., galili, g., and kapulnik, y. identification of a novel genetically controlled step in mycorrhizal colonization: plant res

48、istance to infection by fungal spores but not extra-radical hyphae. plant j, 2001, 27, 561-569.6 dhankher o p, li y, rosen b p, shi j, salt d e, senecoff j, sashti n, meagher rb. engineering tolerance and hyper-accumulation of arsenic in plants by combining arsenate reductase and g-glutamylcysteine

49、synthetase expression. nat biotechnol, 2002, 20:1140-11457 ezawa t., s.e.smith and f.a.smith. p metabolism and transport in am fungi. plant and soil, 2002, 244:221-230 8 gonzalez, e., solano, r., rubio, v., leyva, a., and paz-ares, j. phosphate transporter trafficfacilitator1 is a plant-specific sec

50、12-related protein that enables the endoplasmic reticulum exit of ahigh-affinity phosphate transporter in arabidopsis. plant cell , 2005, 17: 3500-3512.9 gonzalez-chavez c, harris pj, dodd j, meharg aa. arbuscular mycorrhizal fungi confer enhanced arsenate resistance on holcus lanatus. new phytol ,2

51、002, 155:163-17110 harrison m.j., g.r.dewbre and j. liu, a phosphate transporter from medicago truncatula involved in theacquisition of phosphate released by arbuscular mycorrhizal fungi. plant cell, 2002, 14:2413-242911 liu c m, muchhal u s, uthappa m, et al. tomato phosphate transporter genes are

52、differentially regulated in plant tissues by phosphorus. plant physiology, 1998, 116: 91-9912 liu h., a.t.trieu and l.a.blaylock., cloning and characterization of two phosphate transporer from medicagotruncatula roots: regulation in response to phosphate and to colonization by arbuscular mycorrhizal

53、(am) fungi, molecular plant microbe interactions, 1998, 11:14-2213 liu y, zhu y g, chen b d, christie p, li x l. influence of the arbuscular- mycorrhizal fungus glomus mosseaeon uptake of arsenate by the hyper-accumulator fern pteris vittata l. mycorrhiza, 2005a, 15:187-19214 marin a r, masscheleley

54、n p h, patrick w h. the influence of chemical form and concentration of arsenic on rice growth and tissue arsenic concentration. plant soil 1992, 139:175-18315 meharg a a, macnair m r. an altered phosphate uptake system in arsenate-tolerant holcus lanatus l. newphytologist, 1990, 116(1): 29-3516 meh

55、arg a a, macnair m r. suppression of the high affinity phosphate uptake system: a mechanism of arsenate tolerance in holcus lanatus l. j. exp. bot., 1992, 43: 519-52417 meharg a.a. and j.hartley-whitaker., arsenic uptake and metabolism in arsenic resistant and nonresistant plant species, new phytologist, 2002, 154:29-4318