




版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领
文档简介
1、五种电泳技术的比较 本页仅作为文档封面,使用时可以删除 This document is for reference only-rar21 year.March 五种电泳技术的比较 SDSPAGE 名词解释: 相对迁移率(Rf) 问答题: 1简述SDS-PAGE的基本原理。 2影响SDS电泳的关键因素有哪些 AGE 名词解释 1迁移率 2 电渗 3电泳 问答题 1影响电泳迁移率的因素有哪些 2 .试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。 CAME 的基本原理是什么 分离血清蛋白电泳时应注意哪些问题 PAGE 名词解释 1凝胶总浓度 2交联度 问答题 1与CAME相比,PAGE有哪些特点。 2试比较
2、CAME与PAGE操作的区别。 3.简述不连续PAGE的原理。 1 琼脂糖凝胶电泳 Agarose Gel Electrophoresis Gel Electrophoresis :由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支 持体的电泳。 特点(characteristic): 可以制成非常均匀的凝胶,带电质点在凝胶的孔中泳动。 2电泳操作方法简便,电泳速度快。 3分辨率高,重复性好,电泳图谱清晰。 4适用于生化,免疫等定性定量测定。 (_)优点(advantage) 1因不含硫酸根和竣基,几乎消除了琼脂的电渗。 2对蛋白质吸附极微,故无拖尾现象。 3.凝胶结构均匀,孔径较大,可用来分离酶的
3、复合物、核酸、病毒等大分子物 质。 4透明度较好,可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5不吸收紫外光,可直接利用紫外光吸收法作定量测定。 6有热可逆性。 (二)缺点(disadvantage) 1机械强度差,易破碎,浓度不能太低。 2易被细菌污染,不易保存.临用前配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散,电泳后必须立即固定染色。 4与PAGE相比,分子筛(molecular sieve)作用小,区带少。 应用 1适用于大分子的核酸.核蛋白等的分离.鉴定及纯化 2临床生化检验中常用于LDH. CK等同工酶的分离与检测 3为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指标 影响迁移的因素 the size
4、 of the molecule conformation of the molecule the agarose concentration of a gel Voltage 百分浓度和分辨率限制 Most agarose gels are made with between % (good separation or resolution of large 5-10kb DNA fragments) and 2% (good resolution for small -lkb fragments) agarose dissolved in electrophoresis buffer. U
5、p to 3% can be used for separating very tiny fragments but a vertical polyacrylamide gel 聚丙烯酰胺 is more appropriate in this case. Low percentage gels are very weak and may break when you try to lift them. High percentage gels are often brittle and do not set evenly. 1% gels are common for many applic
6、ations. 琼脂糖凝胶分离血浆脂蛋白 原理:血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后,以琼脂糖凝胶为支持介质,在巴 比妥缓冲液中电泳,根据各脂蛋白的组成.大小.形状分离成不同区带。 pH pl,各种脂蛋白均带负电,电泳时由负极到正极;VLDL为圆形, 受阻力小,LDL形态不规则,受阻力大,所以VLDL跑在前。 加样槽在负极,由负极到正极分别是CMLDLVLDLHDL 2醋酸纤维薄膜电泳 Cellulose acetate membrane electrophoresis, CAME 特点:低吸附作用,低电渗作用,样本用量少,亲水性 sorption electroosmosis sample 电泳图
7、谱不齐 点样时血清点加不均匀 薄膜局部干燥 电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少 缓冲液变质 电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行 电泳图谱分理不清 点样时血清点加不均匀 薄膜局部干燥 电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少 缓冲液变质 电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行 电泳速度慢 电流过低 供给薄膜的液量不足 缓冲液离子强度过高 薄膜中杂质 白蛋白区带中间部分不着色,染色不足 染色时间不够、点样过多 Y球蛋白向反方向移动 电渗现象,可提高缓冲液液面或加大电流量以改进 区带一边长一边短呈扭曲现象 薄膜未紧压在电泳槽的滤纸桥上,使薄膜接触不良而增大了电阻。 区带拖尾或区带过于紧密 缓冲液离子强度二可盒
8、现区带拖尾;离子强度可出现区带过于紧密。 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳Separate serum protein in cellulose acetate membrane electrophoresis 原理CAME是以醋纤膜(CAM)作支持物的一种区带电泳技术。 将血清样品点样于醋纤膜上,在的缓冲液中电泳时,血清蛋白质均带负电荷 移向正极。由于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等,加之分 子大小和形状各异,因而电泳迁移率不同,彼此得以分离。加样:用加样器蘸 取血清约5ul,垂直印在CAM粗糙面,点样区距离边缘约,电泳时点样面朝 下。加上槽盖平衡5分钟后再通电。电压10-15V/c
9、m膜总宽。电泳4CT60分 钟,泳动距离约达时即可断电。 山负极到正极可分为五条条带 3聚丙烯酰胺凝胶电泳 Polyacrylamide Gel Electrophoresis PAGE PAG是由丙烯酰胺(acrylamide, Acr)单体和N, 1ST亚甲双丙烯酰胺 (N, N, N N-methylene bisacrylamide, Bis)交联剂通过自由基(fr” radicals)聚合而成的一种多孔三维网状结构。 过硫酸胺(NH4)2S2O8 (Ammonium persulfate, AP)作为催化剂,四甲基乙二 胺(N,NpN:hrtQtramQthylQthylenQ di
10、aminj TEMED)为加速剂。 -TEMED量多少都会影响催化作用,须在碱性条件下聚合 分子氧存在,聚合不完全,须去除分子氧,隔绝氧 升高温度能提高聚合,降低温度能延迟聚合 PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的浓度决定。可以根据要分离物 质分子的大小,选择合适的单体浓度。 Acr/Bis: 2040完全透明且有弹性; 100糊状不成形,易破碎 常用的标准凝胶是指浓度为的凝胶 交联度c一一Bis占单体与交联剂总量的百分比。 C=b/ (a+b) X100% 电极槽缓冲液通常为Tris 甘氨酸缓冲液 分离原理 1. 浓缩效应 1) 凝胶层的不连续性 两层凝胶T与C不同孔径不同 浓缩
11、胶孔径大,分离胶孔径小,蛋白质在大孔径浓缩胶中移动,受阻力小,移 动速度快。 2) 缓冲液离子成分的不连续性 甘氨酸(pl=)在带负电,朝正极移动,进入浓缩胶(),甘氨酸解离度() 很小,有效迁移率(M )很低,移动速度较慢,称为慢离子。 空!是强电解质,=1, CI有效迁移率大,移动速度快,称快离子。 蛋白质(pi)带负电荷,有效迁移率介于两者之间。 3) pH值的不连续性 为了控制慢离子的解离度,从而控制其有效迁移率,必须使浓缩胶与分离胶 之间pH值有所区别。 3分子筛效应与电荷效应 进入分离胶后,Gly成为快离子 分离胶只有电荷效应和分子筛效应,根据各蛋白质所带电荷不同、分子大小 不同而
12、分离 PAGE特点 1具有分子筛效应,分辨率髙 2样品不易扩散,用量少,灵敏度可达10勺 3化学性质稳定,分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团 4凝胶不带电荷,消除了电渗现象 5机械强度好,有弹性,在一定浓度范围内无色透明 6 网孔可调节 十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfateSDS戶Iso called lauryl sulfate) 是一种阴离子去污剂(anionic detergent )。 作用:破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键,使蛋白 质变性(denature)而改变原有的构象; 保证蛋白质分子与SDS充分结合而形成带负电荷的蛋白质SDS复合物
13、。 原理 (一)蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子去污剂和强还原剂后,蛋白质亚基的电泳迁 移率主要取决于亚基分子量的大小(molecular mass of polypeptides ),而电荷因 素可以被忽略。 lx SDS 阴离子去污剂(anionic detergent) 变性剂(denaturant) 助溶性试剂 断裂分子内和分子间的氢键(hydrogen bond) 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构 2、强还原剂 蔬基乙醇(B -mercaptoethanal) 二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT) 使半胱氨酸残基之间的二硫键(disulfid
14、e bond)断裂。 SDS和还原剂的作用: (1) 分子被解聚 (2) 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负 电荷的蛋白质SDS胶束。 (3) 蛋白质SDS胶束所带的负电荷大大超 过了蛋白质分子原有的电荷量,消除 了不同分子之间原有的电荷差异。 去污剂的违择 无离子去污剂:Lubro W; Brij35, Tween Triton 阳离子去污剂:cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) cetylpyyridinium (CPC) 阴离子去污剂:SDS deoxycholate 电泳过程中的不正常现象 (1) 微笑”现象 指示剂前沿呈现两边向上的曲线形,说明
15、凝胶的不均匀冷却,中间部分冷却 不好。 2)“皱眉现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引起的,特别是当凝胶和玻璃板组成的“三明 治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全。 (3) “拖尾现象 样品溶解不佳引起。 (4) 纹理现象 由于样品中的不溶颗粒引起的。 (5)偏斜现象 电极放置不平行引起或加样位置偏斜而引起 (6)带太宽 加样量太多或加样孔泄漏引起 分子量测定 相对迁移率(relative mobility 9 Rf) Rf即用每个带的迁移距离除以漠酚蓝前沿的迁移距离得到的。 测量位置应在蛋白带的中央。 蛋白带迁移距离 Rf= 漠酚蓝迁移距离 蛋白带迁移距离固定前的凝胶长度 Rf=X 干燥后的
16、凝胶长度漠酚蓝迁移距离 2、作图 以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐标,Rf为横坐标绘图 3. 通过测定未知蛋白质的Rf值,便可在标 准曲线上读出他的分子量 5等电聚焦电泳 Isoelectric Focusing Electrophoresis9 IEFE 等电聚焦电泳(IEFE)是一种利用具有pH梯度的支持介质分离等点电(PI)不同的蛋 白质的电泳技术。 原理: 在电泳介质中加入载体两性电解质,通电后,两性电解质会逐渐形成 一个由正极到负极递增的pH梯度,在此体系中,不同的蛋白质移动并聚焦于 与其等电点相当的pH位置。 理想的载体两性电解质应具备的特征 化学性质稳定; 分子量要小 T以便与被分离大分子物质分离; 各成分的Pl彼此接近,并在其Pl值附近有良好的缓冲
温馨提示
- 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
- 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
- 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
- 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
- 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
- 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
最新文档
- 中职文明课件
- 教育心理学在在线学习中的情感支持作用
- 云南省玉溪市新平一中2025年高二物理第二学期期末联考模拟试题含解析
- 智能教育工具对学生学习效果的深度影响
- 广东省清连中学2025届物理高一第二学期期末检测试题含解析
- 教育与科技的完美结合以毛细管电泳仪为例
- 教育政策与心理健康教育的结合
- 智能教学系统在校园的普及与推广
- 教育技术推广中的伦理挑战与机遇
- 数字化转型背景下的教育行业培训需求
- 高血压病课件
- 生殖健康咨询师复习题
- DB4116-T 058-2024 智慧消防物联感知设备配置规范
- 2024年西藏自治区中考化学试题卷(含答案)
- 中间人介绍工作合同模板
- 第3章-机床夹具
- L07G324钢筋混凝土密肋楼板
- 2024年软件测试合同
- 班组长生产管理能力考试题库-上(选择题)
- GB/T 4074.2-2024绕组线试验方法第2部分:尺寸测量
- 欧普照明产品介绍
评论
0/150
提交评论