实验十四--血清胆固醇测定(胆固醇氧化酶法)

1、实验十四血清胆固醇测定（胆固醇氧化酶法）胆固醇的测定方法很多；通常可分为化学试剂比色法、酶法、气相色谱法、高效液相 色谱法、核素稀释质谱法五大类。化学试剂比色法中有直接法和间接法；前者可用血清直 接测定，后者是用溶剂或其它方法提取胆固醇后再作定量。酶法由于操作简便、结果准确， 试剂无腐蚀性，而且因使用特异性酶，大大减少了血液中其它成分的干扰，目前已成为测 定胆固醇的主要方法。【目的】1了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理，能进行血清胆固醇测定的操作。 2.掌握血清胆固醇测定的临床意义。【原理】血清中总胆固醇（tc）包括胆固醇酯(ce)和游离型胆固醇(fc),酯型占 70%，游离型占 30%。

2、胆固醇酯酶（ceh）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸（ffa），胆固醇在胆固 醇氧化酶（cod）的作用下氧化生成4-胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶（pod） 催化氢与 4-氨基安替比林（4-aap）和酚反应，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇 的含量呈正比，在 500nm 波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量。 反应式如下：胆固醇酯ceh胆固醇 脂肪酸胆固醇 o2cod 4 -胆甾烯酮 h2o22h o 4-氨基安替比林 酚 2 2pod红色醌亚胺【器材】试管、吸管、试管架、微量加样器、恒温水浴箱、分光光度计。 【试剂】酶法测定胆固醇多采用市售试剂盒。1. 酶应用

3、液 胆固醇酶试剂的组成为：ph6.7 磷酸盐缓冲液 50mmol/l胆固醇酯酶 200u/l胆固醇氧化酶 100u/l过氧化物酶 3 000u/l4-氨基安替比林 0.3 mmol/l苯酚 5 mmol/l此外还含有胆酸钠和 triton x-100 ，胆酸钠是胆固醇酯酶的激活剂，表面活性剂 triton x-100 能促进脂蛋白释放胆固醇和胆固醇酯，有利于胆固醇酯的水解。2 5.17 mmol/l（200mg /dl）胆固醇标准液精确称取胆固醇 200mg 溶于无水乙醇，移入 100ml 容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度 (也可用异丙醇等配制)。【操作】取试管 3 支，编号，按下操作。表 3-

4、15 酶法测定血清胆固醇操作步骤加入物（ml）血清胆固醇标准液 蒸馏水酶应用液测定管0.022.00标准管0.022.00空白管0.022.00混匀后，37水浴保温 15 分钟，在 500nm 波长处比色，以空白管调零，读取各管吸光 度。【计算】血清胆固醇 (mmol/l) 【注意事项】测定管吸光度 标准管吸光度 5.171. 黄疸血清过高的胆红素可还原部分反应中的 h o ，降低显色反应，使结果偏低。2 2但测定胆固醇，胆红素对酶法的干扰比化学法小。2. 用胆固醇标准液引起的误差较大，故目前提倡采用胆固醇定值血清为标准。3. 轻度溶血对测定结果无影响，但明显溶血可使结果增高，此时可用一个不加 cod 的空白管从结果中减去后纠正。4. 其它影响因素，如维生素 c、谷胱甘肽、氟化物引起负偏差。【正常参考范围】3.105.70mmol/l【临床意义】1. 血清胆固醇增高 常见于动脉粥样硬化、原发性高脂血症、糖尿病、肾病综合征、胆管阻塞、甲状腺功能减退。2. 血清胆固醇降低 常见严重贫血、甲状腺功能亢进、长期营养不良等。 【结果及分析】【思考题】1胆固醇有