质粒DNA的提取碱裂解法

1、质粒DNA的提取（碱裂解法）实验原理：碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在 pH 值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一 起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使 pH降低后，共价 闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线 状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而 准确地复性，它们缠绕形成网状结构。 通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子 RNA蛋白质-SDS复合物等一起沉

2、淀下来， 而质粒DNA却留在上清液中。提取步骤：1. 吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4C下12000rpm离心2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥2. 加入100卩LSolution I,枪头充分打匀，使细胞重新悬 浮。此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降 低抽提得率3. 加入200卩L新配制的Solution H,轻柔颠倒混匀（千万不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min ）。这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合， 不然基因组DNA也会断裂。4. 加入150卩L solution川，颠倒混匀（

3、温和振荡 10秒），使溶液川在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀5. 4C下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的 1.5mL 离心管中6. 力口入6卩L 10卩gl/卩L的RaseA 混匀，37C温浴30min。7. 等体积TriS饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提1次，小心将上清吸至新的1.5mL离心管中8. 等体积氯仿：异戊醇（24:l）抽提1次，小心将上清吸至新的1.5mL离心管中9. 加入 2.5 倍体积的冰冻无水乙醇，冰浴 0.5-1h ，沉淀双 链 DNA。10. 4C下12000rpm离心5min，吸干上清液11. 力口 70%乙醇1m

4、L颠倒数次，使质粒悬浮，12000rpm离心 5min。12. 吸干上清液，12000rpm离心1min，吸干乙醇。室温放置或超净工作台上风干质粒DNA约10min13. 加20卩L灭菌ddfO或TE缓冲液充分溶解14. 用紫外分光光度计检测其纯度和浓度后置于-20 C保存备用。注意事项：1. 提取过程应尽量保持低温。 提取质粒DNA过程中除去蛋白 很重要 , 采用酚 / 氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好 , 要将蛋白尽量除干净需多次抽提2. 沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA可用异丙醇(一般使用等体积), 无水乙醇( 2-2.5 倍体积)3.

5、6、7、8 步骤是抽提蛋白的过程，根据实验要求，可以省 略4. 质粒DNA电泳会有三条带，最远的是线形DN(IDNA):质 粒 的 两条 链 均断裂， 线 性分 子； 中 间 的 是 开环 DNA (ocDNA): 质粒的一条链断裂，松弛的环状分子；共价 闭合环状 DNA(cccDNA): 质粒的两条链没有断裂， 超螺 旋相关溶液的参考配方 :SoIution I50mmo1 L葡萄糖5mmo1 L 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷(Tris)Tris HCI(pH8.0)1.0 mmo1L乙二胺四乙酸 (EDTA)(pH8.0)SoIution II0.4mo1 / L NaOH, 2 % S

6、DS(十二烷基硫酸钠)，用前等体积混合Solution III5mo1/L 醋酸钾60 mL冰乙酸11.5mL水28.5mL相关溶液的作用1、溶液I的作用对于任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此选用适当浓度和适当pH值的Tris-CI溶液。加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂， 可以抑制DNase的活性和微生物生长。此步骤菌体一定要 悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。2、溶液II的作用NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱后几乎在瞬间就会 溶解，这是由于细胞膜发生了从bi

7、layer （双层膜）结构向micelle （微囊）结构的相变化所导致。SDS也呈碱性，但如果只用SDS，达不到彻底溶解细胞的作用，加入SDS主要为下一步做铺垫。 这一步操作要注意两点：第一，时间不 能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。3、溶液III的作用SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。溶液中的K+置换了 SDS中的Na+而形成了不溶性的 PDS，高浓度 的盐使沉淀更完全。同时，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀。2 M的

8、醋酸可以中和 NaOH，因为长时间的 碱性条件会打断 DNA。基因组 DNA 一旦发生断裂，小于 100 kb的片断，就不容易与PDS共沉淀。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有 大量的基因组 DNA污染。这一步操作混合均匀后在冰上放 置，可以使PDS沉淀更充分。4、酚/氯仿/异戊醇的作用 PDS的沉淀并不能将所有的蛋白 质沉淀，酚可以使蛋白质变性，作用大于氯仿，但水饱和酚 的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后酚相会跑到 上层，不利于含质粒的水相的回收。加入氯仿后可以增加其 比重，使得酚 /氯仿始终在下层， 方便水相的回收。 还有， 酚 与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶 解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反 应），因此如