荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV课件

1、荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV1 荧光定量PCR的原理及临床应用 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV2 如何做一个如何做一个“聪明聪明”的实习生的实习生 l实习的目的就是对在校所学的理论知识和实验技实习的目的就是对在校所学的理论知识和实验技 能，在临床的实际工作中进行实践、巩固和提高。能，在临床的实际工作中进行实践、巩固和提高。 l如何做到：如何做到： 实习之前要复习理论知识和实验课内容实习之前要复习理论知识和实验课内容 “理论先行理论先行” 实习过程中要实习过程中要“聪明聪明” 做好实习笔记，用心思考，做好实习笔记，用心思考，实习之外下功夫实习之外下功夫 荧光

2、定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV3 如何做一个如何做一个“聪明聪明”的实习生的实习生 聪聪 明明 耳：认真听老师的说明和讲解耳：认真听老师的说明和讲解 看：仔细看老师的操作看：仔细看老师的操作 问：有疑问要多提问，多讨论问：有疑问要多提问，多讨论 心：要用心去思考心：要用心去思考 日月：要每天每月坚持做到日月：要每天每月坚持做到 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV4 内容概要内容概要 lPCR的定义和原理的定义和原理 l荧光定量荧光定量PCR的原理和分类的原理和分类 l荧光定量荧光定量PCR结果的分析结果的分析 l荧光定量荧光定量PCR在临床的应用在临床的应用 荧光定

3、量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV5 PCR的定义的定义 l PCR是 是Polymerase Chain Reaction的缩写，中的缩写，中 文称为文称为聚合酶链式反应聚合酶链式反应，由，由变性变性、退火退火及及延延 伸伸几步反应组成一个周期几步反应组成一个周期,循环进行循环进行,可使目可使目 的的DNA得以迅速扩增。得以迅速扩增。 l 由美国由美国PE公司遗传部的公司遗传部的Dr. Mullis发明，由于发明，由于 PCR技术的跨时代意义，技术的跨时代意义，Mullis获得了获得了1993年年 诺贝尔化学奖。诺贝尔化学奖。 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV6 PC

4、R的原理的原理 l变性变性：双链：双链DNA在高温下解开成单链的过程在高温下解开成单链的过程 。温。温 度一般为度一般为95左右。左右。 5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3 3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5 5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3 3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV7 PCR的原理的原理 l退火退火：温度下降后，两条配对的单链：温度下降后，两条配对的单链DNA重新重新 结合为双链的过程。温度一般为结合为双链的过程。温度一般为5060。 5CCACTGC

5、CTCTC CCTGAGCTGTGA3 3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5 CCACTGCCTCTC GGACTCGACACT 5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3 3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5 CCACTGCCTCTCGGACTCGACACT 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV8 PCR的原理的原理 l延伸延伸：DNA聚合酶催化以引物为起始点的聚合酶催化以引物为起始点的DNA 链延伸反应链延伸反应 。温度一般为。温度一般为72左右。左右。 5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3 3GGTGACGGA

6、GAG GGACTCGACACT5 CCACTGCCTCTC GGACTCGACACT 5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3 3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5 CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV9 普通普通PCR的原理的原理 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV10 普通普通PCR的原理的原理 lPCR反应成分：反应成分： 1.模板模板DNA 2.引物引物 3.四种脱氧核糖核苷酸四种脱氧核糖核苷酸 4.DNA聚合酶聚合酶(Ta

7、q酶酶) 5.反应缓冲液、反应缓冲液、Mg2+等等 6.荧光探针（荧光定量荧光探针（荧光定量PCR） 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV11 Taq酶的发现酶的发现 l在在Taq酶发现之前，实验室的酶发现之前，实验室的PCR反应中运用反应中运用 的是大肠杆菌的是大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶的的Klenow片段。片段。 lKlenow酶不耐高温，酶不耐高温，90加热后会加热后会变性失活变性失活， 每次循环结束都要加入新鲜的酶。每次循环结束都要加入新鲜的酶。 l而且而且DNA的延伸是在的延伸是在37完成，模板和引物容完成，模板和引物容 易错配，造成反应的易错配，造成反应的特异性很差特异

8、性很差。 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV12 Taq酶的发现酶的发现 l美国的嗜热菌研究室在黄石国家公园温泉中发美国的嗜热菌研究室在黄石国家公园温泉中发 现了嗜热菌现了嗜热菌(Thermus aquaticus)株，株，Cetus公司公司 研究人员从中分离了研究人员从中分离了Taq DNA聚合酶聚合酶 l特点：特点：耐高温：耐高温：70 2h 活性活性90%，93 2h 活性活性60%，95 2h 活性活性40% ； 延伸温度延伸温度 较高较高(一般为一般为72 )：大大：大大提高了扩增特异性、提高了扩增特异性、 灵敏性和扩增效率灵敏性和扩增效率。 荧光定量PCR的原理及临床

9、应用2学生讲课HCMV13 荧光定量荧光定量PCR l概念：在概念：在PCR反应中加入反应中加入荧光基团荧光基团，利用荧光，利用荧光 信号累积或变化实时监测信号累积或变化实时监测整个反应过程，最后整个反应过程，最后 通过特定数学模型对未知模板进行定量分析的通过特定数学模型对未知模板进行定量分析的 方法。方法。 l实时荧光定量实时荧光定量PCR技术于技术于1996年由美国年由美国Applied Biosystems，ABI公司公司推出，实现了推出，实现了PCR从定性从定性 到定量的飞跃。到定量的飞跃。 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV14 实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理的原

10、理 l利用利用荧光信号的变化荧光信号的变化实时监测实时监测PCR反反 应的每个循环的扩增产物量的变化。应的每个循环的扩增产物量的变化。 l通过通过Ct值值和和标准曲线分析标准曲线分析对起始标本对起始标本 的模板量进行定量分析。的模板量进行定量分析。 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV15 与普通与普通PCR的比较的比较 l普通普通PCR完成后，一般只对扩增的最终完成后，一般只对扩增的最终 产物量进行分析，分析结果多为产物量进行分析，分析结果多为定性定性 或者半定量或者半定量结果。结果。 l荧光定量荧光定量PCR通过监测荧光值的变化，通过监测荧光值的变化， 体现每一个循环的扩增产物

11、量的变化，体现每一个循环的扩增产物量的变化， 分析结果为分析结果为定量定量结果。结果。 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV16 与普通与普通PCR的比较的比较 l普通普通PCR完成后，才能进行扩增产物的完成后，才能进行扩增产物的 分析，而且分析的过程可能产生一定的分析，而且分析的过程可能产生一定的 生物危害和环境污染生物危害和环境污染。 l荧光定量荧光定量PCR的扩增和产物分析过程是的扩增和产物分析过程是 同时完成同时完成的，而且在的，而且在封闭封闭的反应体系中的反应体系中 进行，比较安全，易于处理。进行，比较安全，易于处理。 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV17

12、 常用的名词概念常用的名词概念 l本底信号（本底信号（Baseline） l荧光阈值（荧光阈值（Threshold） lCt值（值（Ct value） l扩增曲线扩增曲线 前前15个循环荧光信号的均值，可个循环荧光信号的均值，可 手动调节选择手动调节选择 默认是第默认是第315个循环的荧光信号的标个循环的荧光信号的标 准偏差的准偏差的10倍，也可手动调节倍，也可手动调节 扩增过程中，产物的荧光信号达到设定的阈值扩增过程中，产物的荧光信号达到设定的阈值 时所经过的扩增循环数时所经过的扩增循环数 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV18 常用的名词概念常用的名词概念 Threshold

13、 Baseline Ct value 荧光强度荧光强度 Rn 扩增循环数扩增循环数 对数增长期对数增长期 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV19 实际中的运用实际中的运用 左图为左图为5个数量级的标准品扩增后得到的荧光曲线，个数量级的标准品扩增后得到的荧光曲线， 右图以右图以Ct值为纵坐标，值为纵坐标，lgXs为横坐标，可计算得出标准曲线为横坐标，可计算得出标准曲线 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV20 实时荧光定量实时荧光定量PCR的分类的分类 l目前的实时荧光定量目前的实时荧光定量PCR均是基于均是基于荧光共振能荧光共振能 量转移量转移（Fluorescenc

14、e resonance energy transfer，FRET）的原理。）的原理。 FQ 10nm F Fluorophore, 荧光基团荧光基团 Q Quencher， 淬灭基团淬灭基团 FQ 10nm 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV21 荧光共振能量转移（荧光共振能量转移（FRET）发生的条件）发生的条件 l荧光基团和淬灭基团都能发射荧光荧光基团和淬灭基团都能发射荧光 l荧光基团的荧光基团的发射光谱发射光谱和淬灭基团的和淬灭基团的激发光谱激发光谱需需 有效重叠有效重叠 l荧光基团和淬灭基团应足够的近（荧光基团和淬灭基团应足够的近（500bp片段敏感片段敏感 75%或无水

15、乙醇溶液喷雾或无水乙醇溶液喷雾 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV33 荧光定量荧光定量PCR在临床的应用在临床的应用 l在反应体系中使用在反应体系中使用dUTP和和UNG酶消除以酶消除以 往实验的污染影响往实验的污染影响 UNG酶（尿嘧啶酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）：选择性糖基化酶）：选择性 水解断裂含有水解断裂含有dU的双链和单链中的尿嘧的双链和单链中的尿嘧 啶糖苷键，在碱性介质和高温下会进一啶糖苷键，在碱性介质和高温下会进一 步水解断裂，酶的最佳活性温度是步水解断裂，酶的最佳活性温度是50， 在在95 失活。失活。 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV34 荧光定

16、量荧光定量PCR在临床的应用在临床的应用 气溶气溶 胶污胶污 染物染物 50 2min， 95 灭活 加入加入 UNG酶酶 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV35 荧光定量荧光定量PCR在临床的应用在临床的应用 5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3 5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3 加入加入dUTP 5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3 5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3 5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3 CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3 5CCACUGCCUC

17、UC CCUGAGCUGUGA3 5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3 5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3 5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3 5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3 潜在气溶胶污染物潜在气溶胶污染物 加入加入UNG酶酶 5断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段3 5断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段3 5断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段3 5断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段3 5断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段3 5断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段3 5断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段3 5断裂的核苷酸片段断裂

18、的核苷酸片段3 5断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段3 5断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段3 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV36 荧光定量荧光定量PCR在临床的应用在临床的应用 l乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA) lEB病毒病毒DNA(EBV-DNA) l人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA(HCMV-DNA) l肺炎支原体肺炎支原体DNA(MP-DNA) l肺炎衣原体肺炎衣原体DNA(CP-DNA) 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV37 临床标本的采集临床标本的采集 检检 测测 项项 目目标标 本本 类类 型型 及及 要要 求求 HBV-DNA血清或

19、者血浆血清或者血浆 100l(不可用肝素抗凝不可用肝素抗凝) EBV-DNA血清血清100l或抗凝全血或抗凝全血 1ml(不可用肝素抗凝不可用肝素抗凝) HCMV-DNA血清血清100l或抗凝全血或抗凝全血 1ml (不可用肝素抗凝不可用肝素抗凝) MP-DNA CP-DNA 咽拭子、痰液或肺支气管灌洗液咽拭子、痰液或肺支气管灌洗液 1ml 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV38 人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒 l用于器官移植、骨髓移植及用于器官移植、骨髓移植及HIV阳性阳性 /AIDS患者人巨细胞病毒感染的患者人巨细胞病毒感染的辅助诊断辅助诊断 和疗效监控和

20、疗效监控。 l临床上可以采用的标本类型：临床上可以采用的标本类型：尿液尿液、乳乳 汁汁、血清、血浆或血清、血浆或淋巴细胞淋巴细胞样本中人巨样本中人巨 细胞病毒细胞病毒DNA。 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV39 人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒 l巨细胞病毒巨细胞病毒DNA的提取（血清或血浆）的提取（血清或血浆） 100l 血清血清 或血浆或血浆 100l DNA浓浓 缩液缩液 去除上清去除上清 液，保留液，保留 沉淀沉淀 12000rpm， 10min 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV40 人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒

21、 巨细胞病毒巨细胞病毒DNA的提取（血清或血浆）的提取（血清或血浆） 加入加入 50l DNA提提 取液取液 剧烈振荡剧烈振荡 混匀混匀5-10s 100 加热加热 10min 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV41 人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒 l巨细胞病毒巨细胞病毒DNA的提取（血清或血浆）的提取（血清或血浆） 4放放 置或用置或用 于于PCR 振荡混匀振荡混匀 510s 12000rpm， 5min 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV42 人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒 l巨细胞病毒巨细胞病毒DNA的提取（尿液和乳汁）

22、的提取（尿液和乳汁） 1ml尿液尿液 或乳汁或乳汁 去除上清去除上清 液，保留液，保留 沉淀沉淀 12000rpm， 5min 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV43 人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒 l巨细胞病毒巨细胞病毒DNA的提取（尿液和乳汁）的提取（尿液和乳汁） 加入加入 50l DNA提提 取液取液 剧烈振荡剧烈振荡 混匀混匀5-10s 100 加热加热 10min 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV44 人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒 l巨细胞病毒巨细胞病毒DNA的提取（尿液和乳汁）的提取（尿液和乳汁） 4放放 置或

23、用置或用 于于PCR 振荡混匀振荡混匀 510s 12000rpm， 5min 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV45 人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒 l人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA的提取（淋巴细胞的提取）的提取（淋巴细胞的提取） 1ml抗抗 凝全血凝全血 1ml生生 理盐水理盐水 0.3ml淋巴淋巴 细胞分离液细胞分离液 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV46 人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒 l人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA的提取（淋巴细胞的提取）的提取（淋巴细胞的提取） 水平离心机水平离心机 2500rpm，15min

24、淋巴细胞层淋巴细胞层 吸取淋巴吸取淋巴 细胞悬液细胞悬液 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV47 人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒 l人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA的提取（淋巴细胞的提取）的提取（淋巴细胞的提取） 淋巴细胞淋巴细胞 悬液悬液 去除上清去除上清 液，保留液，保留 沉淀沉淀 12000rpm， 5min 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV48 人巨细胞人巨细胞病毒病毒DNA定量检测试剂盒定量检测试剂盒 l人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA的提取（淋巴细胞的提取）的提取（淋巴细胞的提取） 加入加入 50l DNA提提 取液取液 剧烈振荡剧烈振

25、荡 混匀混匀5-10s 100 加热加热 10min 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV49 人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒 l人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA的提取（淋巴细胞的提取）的提取（淋巴细胞的提取） 4放放 置或用置或用 于于PCR 振荡混匀振荡混匀 510s 12000rpm， 5min 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV50 荧光定量荧光定量PCR扩增过程扩增过程 50 94 2min 5min 93 15s 57 30s Stage1Stage2Stage3 45 1 1 25 1min Stage4 1 荧光定量PCR的原理及临床

26、应用2学生讲课HCMV51 DNA浓缩液的作用浓缩液的作用 lDNA浓缩液的成分：浓缩液的成分：PEG6000、NaCl lPEG（聚乙二醇）的作用：（聚乙二醇）的作用：PEG与自由水分子与自由水分子 结合，同时蛋白质表面的水化膜被夺走，与水结合，同时蛋白质表面的水化膜被夺走，与水 分子结合的极性集团转而与多聚物的氧原子或分子结合的极性集团转而与多聚物的氧原子或 者氢氧根结合，形成蛋白质与多聚物的复合体，者氢氧根结合，形成蛋白质与多聚物的复合体， 从溶液中沉淀析出。从溶液中沉淀析出。提高低浓度标本的检出率提高低浓度标本的检出率。 lPEG的浓度与沉淀出的的浓度与沉淀出的DNA片段大小成反比。片

27、段大小成反比。 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV52 DNA浓缩液的作用浓缩液的作用 lNaCl的作用：在细胞内的作用：在细胞内DNA与蛋白质结合成与蛋白质结合成脱脱 氧核糖核蛋白氧核糖核蛋白DNP ，而，而RNA与蛋白质结合成为与蛋白质结合成为 核糖核蛋白核糖核蛋白RNP,在不同盐浓度中二者溶解度不在不同盐浓度中二者溶解度不 一样。一样。 lDNP在纯水或者在纯水或者12M的的Nacl溶解度较大，在溶解度较大，在 0.14M溶解度较低，而溶解度较低，而0.14M中中RNP溶解度较大，溶解度较大， 因此因此利用利用0.14M可分离可分离RNP和和DNP。 荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV53 DNA提取液的作用提取液的作用 lDNA提取液的主要成分：提取液的主要成分： NP-40 TritonX-100 Chelex-100 EDTA(pH8.0) Tris-HCl (pH 8.0) NaOH （乙基苯基聚乙二醇）很温和的去垢剂，（乙基苯基聚乙二醇）很温和的去垢剂，1%浓度的基本可以破浓度的基本可以破 坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱 （聚乙二醇辛基苯基醚（聚乙二醇辛基苯基醚 ）一种非离子