蛋鸡抗体检测实验室建设方法

1、蛋鸡抗体检测实验室建设方法蛋鸡抗体检测实验室建设方法一、面积、台面、墙面面积至少要有 6平方，放置一张操作台(桌子，面要平，长 1.5 米，宽 1米)， 一张凳子，墙用彩钢板隔开，制作一个门，保持空间独立。二、器材1、一台小高压锅，用于灭菌。2、冰箱，用于盛放易耗品等。3、离心机( 5000转以下)一台，用于制作红细胞。4、移液枪两把，一把为 1 毫升的，另一把为 200 微升的。5、电子天平一台。三、耗材1、枪头，1 毫升的及 200微升的，各 500 个。2、盛放枪头的盒子，两种规格，各 5 个。3、Ependorf 管 100个， Ependorf 管架 2 个。4、葡萄糖瓶子 10 各

2、。5、量筒 2 个。6、记号笔一支。四、血凝试验 (HA) 定义：某此病毒或病毒的血凝素，能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(hemagglutination , HA)，也称直接血凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验 (HA)血凝抑制试验 (HI)定义：当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒 或其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这 时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(hemagglutination inhibiion ， HI) 反应，也称血凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝

3、试 验 (HI) 。原理：特异性抗体与相应病毒结合，使病毒失去凝集红细胞的能力，从而抑制 血凝现象。用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鉴定根据抗原与相应抗体的特异性中和反应原理，给未知病毒悬液中加入已知的抗 禽流感病毒阳性血清或已知的抗新城疫病毒阳性血清，相应病毒便丧失了其凝集红细胞的能力。因此，可利用从发病的鸡、鸭、鹅体内分离的病毒作HA和HI试验。病毒悬液能凝集红细胞，并且能被已知的抗血清(阳性血清)所抑制， 那么该病毒即是已知阳性血清相对应的病毒。如用新城疫阳性血清完全抑制了 未知病毒培养物的血凝性，那么，这个未知病毒培养物就是新城疫病毒；如果 病毒悬液虽然能凝集鸡红细胞，但不能被鸡新

4、城疫血清所抑制，说明不是鸡新 城疫病毒，可能是其他有血凝性的病毒。阿氏（ Alsevers ）液配制称量葡萄糖 2.05g 、柠檬酸钠 0.8g 、柠檬酸 0.055g 、氯化钠 0.42g ，加蒸馏水至100mL散热溶解后调pH值至6.1 , 69kPa 15min高压灭菌，4C保存备用 PBS液配制：称取 8g NaCl 、0.2g KCl 、1.44g Na2HPO4 和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用 HCI 调节溶液的 pH 值至 7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。在15lbf/in2（1034W5Pa）高压下蒸气灭菌（至少20分钟），保存于4C冰箱中。1%鸡红

5、细胞液的制备2.1采血 用注射器吸取阿氏液约1mL取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡， 可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约24mL与阿氏液 混合，放入装10mL阿氏液的离心管中混匀。2.2 洗涤鸡红细胞 将离心管中的血液经 15001800 r/min 离心 8分钟，弃上 清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合，再经 15001800 r/min 离心 8分钟，用 吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复 2 次以上过程后，加 入阿氏液20 mL，轻轻混合成红细胞悬液，4C保存备用，不超过5天。2.3 10% 鸡红细胞悬液 取阿氏液保存不超过 5 天的红细胞，在锥形刻

6、度离心 管中离心 15001800 r/min 8 分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细 胞体积（mL），加入9倍体积（mL）的PBS用吸管反复吹吸使PBS与红细胞混合均 匀。2.4 1%鸡红细胞液 取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1 mL，加入9 mLPBS混 合均匀即可。抗原血凝效价测定（HA试验，微量法）3.1在微量反应板的1孔12孔均加入25卩LPBS换滴头。3.2吸取25卩L病毒悬液加入第l孑L,混匀。3.3从第1孔吸取25卩L病毒液加入第2孑L,混匀后吸取25卩L加入第3孑L,如 此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取25卩L弃之，换滴头。3.4每孔再加入25卩L PBS。3

7、.5每孔均加入25卩L体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀 后加入）3.6振荡混匀，在室温（2025 T）下静置40min后观察结果（如果环境温度太 高，可置4C环境下反应1小时）。对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。 结果判定 将板倾斜，观察血凝板，判读结果将板倾斜（ 45 度左右），观察血凝 板，判读结果：+：红细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即 100%红细胞凝集：红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈 ：红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块： 红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块 ：红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细胞完全不凝集 能使红细胞完全凝集（ 100%凝集

8、， +）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝 效价，此效价为 1 个血凝单位（ HAU）。注意！ 对照孔应呈现完全不凝集（ - ），否则此次检验无效血凝抑制试验（ HI 试验 微量法）4.1根据3的试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数 作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血 凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。4.2在微量反应板的1孔11孔加入25卩L PBS,第12孔加入50卩L PBS。4.3吸取25卩L血清加入第1孔内，充分混匀后吸25卩L于第2孔，依次对倍 稀释至第10孔，从第10孔吸取25卩L弃去。4.4 1孔11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液25卩L,室温（约20C）静置 至少 30min。4.5每孔加入25卩L体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约 40min （室温约20C，若环境温度太高可置 4C条件下进行），对照红细胞将呈 现钮扣状沉于孔底。4.6 结果判定以完