全血线粒体DNA萃取试剂盒产品说明书中文版

1、全血线粒体DNA萃取试剂盒产品说明书(中文版) 主要用途 全血线粒体DNA萃取试剂是一种旨在通过化学溶解纯化血白细胞、物理或化学破膜及离心处理获得线粒 体，然后进一步生物酶处理以获得高质量的线粒体DNA的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、 成功实验证明的。其适用于各种动物血细胞中的线粒体核酸成分处理。用于后续的杂交、克隆、酶切、PCR 分析等。产品即到即用，操作简易，性能稳定，无核酶污染，萃取纯度和产量皆高。 技术背景 线粒体细胞器的研究是现代细胞生物学的最重要的课题之一。线粒体成为生物衰老、古生物、细胞凋亡、 肿瘤、HIV、老年痴呆症、糖尿病、肌肉疾病等研究的主要对象。线粒体DNA的

2、分离和定量以及突变分析 是研究中必不可少的。 产品内容 溶血液(Reagent A) 毫升 清理液(Reagent B) 毫升 裂解液(Reagent C) 毫升 净化液(Reagent D) 毫升 强化液(Reagent E) 毫升 保存液(Reagent F) 毫升 破膜液(Reagent G) 毫升 去干扰液(Reagent H) 微升 酶解液(Reagent I) 微升 萃取液(Reagent J) 毫升 浓缩液(Reagent K) 毫升 助沉液(Reagent L) 微升 沉淀液(Reagent M) 毫升 纯化液(Reagent N) 毫升 缓冲液(Reagent O) 毫升 产

3、品说明书1份 保存方式 保存净化液(Reagent D)、 去干扰液(Reagent H)、 酶解液(Reagent I)、萃取液(Reagent J和 助沉 液(Reagent L)在20C冰箱里，其余的保存在4 C冰箱里，有效保证 6月 用户自备 1.5毫升离心管：用于核酸操作的容器 15毫升锥形离心管：用于线粒体初步制备的容器 50毫升锥形离心管：用于血细胞处理的容器 涡旋震荡仪：用于混匀 4C微型台式离心机：用于沉淀细胞和核酸 4C超速离心机：用于分离细胞器成分 DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞 58 C恒温水槽：用于孵育反应物 实验步骤 一、白细胞分离 实验开始前，室温预热血溶液(R

4、eagent A),同时4C预冷 清理液(Reagent B)。然后进行下列操作。 1. 准备2个无菌的50毫升锥形离心管 2. 轻轻混匀新鲜的EDTA抗凝的全血样品 3. 分别移出5毫升全血样品到每个 50毫升锥形离心管 4. 分别加入毫升室温预热的 血溶液(Reagent A) 5. 轻轻上下倾倒离心管 5次，确保充分混匀 6. 室温下(25C)孵育4分钟，期间轻轻上下倾倒离心管数次(注意：肉眼可以观察到血液颜色由不透 明红色到清澈红色的变化) 7. 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g & 小心抽掉上清液，留下 500微升液体，以防抽掉白细胞颗粒群 9. 用手指轻弹离心管2至3下，使

5、白细胞颗粒群松动 10. 分别加入毫升预冷的 清理液(Reagent B)，混匀细胞 11. 2管50毫升锥形离心管合并为 1管 12放进台式离心机离心10分钟，速度为300g 13. 小心抽去上清液 14. 加入毫升预冷的 清理液(Reagent B)，混匀细胞 15放进台式离心机离心10分钟，速度为300g 16.小心抽去上清液，确保没有液体残留(注意：如果暂时停止操作，须暂时放进一70C冰箱里) 二、白细胞线粒体分离 实验开始前，将试剂盒里的 净化液(Reagent D)冻融，然后移出毫升 净化液(Reagent D)和 毫 升的 裂解液(Reagent C)到15毫升锥形离心管里，混匀

6、后，标记为裂解工作液，置入冰槽里备用。然 后进行下列操作，根据用户要求选择其中一种方法： 方法一：细胞匀浆法 1. 加入预冷的毫升裂解工作液 2. 涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群 3. 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器 4. 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞(约 20至40下)(注意：参见注意事项11) 5. 将所有细胞匀浆物移入 15毫升锥形离心管 6. 放进4C台式离心机离心10分钟，速度为1500g 7. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管一一此步骤去除细胞核和未溶解的细胞 8 放进4C超速离心机离心10分钟，速度为10000g 9. 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒 一一此步骤获

7、得线粒体沉淀物 方法二、化学处理法 1. 加入预冷的毫升裂解工作液 2. 涡旋震荡5秒，充分混匀 3. 在冰槽里孵育2分钟，其中每间隔一分钟涡旋震荡5秒 4. 加入预冷的微升 强化液(Reagent E) 5. 涡旋震荡5秒，充分混匀 6. 在冰槽里孵育5分钟，其中每间隔一分钟涡旋震荡5秒(注意：参见注意事项12) 7. 加入预冷的毫升 保存液(Reagent F)，用手指轻弹混匀 8 放进4C台式离心机离心10分钟，速度为1500g 9. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管一一此步骤去除细胞核和未溶解的细胞 10. 放进4C超速离心机离心10分钟，速度为10000g 11小心

8、抽去上清液，保留沉淀颗粒一一此步骤获得线粒体沉淀物 三、DNA萃取 1. 加入 微升破膜液(Reagent G)到线粒体颗粒样品中 2. 涡旋震荡15秒，混匀颗粒群 3. 转入1.5毫升离心管 4. 置入冰槽中孵育15分钟 5. 加入 微升 去干扰液(Reagent H) 6. 用200微升枪头上下抽吸混匀 7. 放进37C恒温水槽孵育15分钟 8 加入 微升酶解液(Reagent I) 9.涡旋震荡15秒 10放进58C恒温水槽或干式恒温仪孵育2小时(注意：可以孵育4至16小时，增加萃取产量) 11置于室温下冷却15分钟，直至处于室温状态(或置于冰槽里15至30秒) 12. 加入 微升 萃取

9、液(Reagent J)(注意：使用前摇匀) 13 涡旋震荡15秒 14.放进微型台式离心机离心 10分钟，速度为16000g (或13000RPM，例如eppendorf 5415) 15移出上层液相溶液到新的1.5毫升离心管(注意：切莫触碰液相交界面上的白色膜状物) 16. 加入微升 浓缩液(Reagent K) 17. 加入微升助沉液(Reagent L) 18. 加入微升 沉淀液(Reagent M) 19在涡旋震荡仪上震荡 15秒，充分混匀 20.放进微型台式微型离心机离心15分钟，速度为16000g (或13000RPM，例如eppendorf 5415)(注意: 离心前做好方位标

10、记，以便离心后观察管底沉淀颗粒) 21 小心抽掉上清液 22. 加入毫升纯化液(Reagent N) 23. 放进微型台式离心机离心 5分钟，速度为16000g (或13000RPM，例如eppendorf 5415) 24. 小心抽掉上清液 25. 空气中晾干沉淀颗粒群 26. 加入微升缓冲液(Reagent O) 27溶解后放进20C冰箱长期保存或移出 2微升进行PCR反应 注意事项 1. 本产品为20次操作 2. 操作时，避免污染母液，尤其是 裂解液(Reagent C)和 保存液(Reagent F) 3. 线粒体操作均须在4 C或以下状态下进行 4. 操作时，须戴手套 5. 建议使用

11、新鲜全血 6. 全血样品采集建议使用EDTA血液抗凝液(HL12054.1 )、 ACD血液抗凝液(HL12054.2 )或肝 素钠血液抗凝液(HL12054.3 ) 7. 试剂中的溶液使用前摇匀；酶解液(Reagent I)需放进37C温育少许；为避免反复冻融，建议适量 分装 8 建议全血样品和 血溶液(Reagent A)充分混匀，否则造成血红细胞的不完全溶解 9. 建议全血样品和 血溶液(Reagent A)孵育时间避免过长，不宜超过5分钟，以防白细胞损害 10. 每毫升全血平均可获得 2.5 X 106白细胞 11通常匀化次数为 20至40下(或细胞颗粒群消失为止)达到80%的细胞裂解为理想状态，但不同的细 胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆 环。低于50%可以增加匀化次数 12通常孵育5分钟(不宜超过5分钟)达到80%的细胞裂解为理想状态， 但不同的细胞类型会存在差异。 用户可以通过显微镜观察 3微升裂解物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50%可以增 加孵育时间和涡旋震荡次数 13. 可以通过增加线粒体溶解时间(30分钟)和酶解时间(直至 16小时)，获