流式细胞仪检测外周血树突状细胞

1、.流式细胞仪检测外周血树突状细胞分析 CD123+ （抗 IL-3 受体链）和 CD11c+ 树突状细胞亚群概述树突状细胞 （DC）的主要功能是吸收抗原 ，进行加工 ，并向 T 淋巴细胞呈递 。其它抗原呈递细胞也有此功能，如 B 淋巴细胞和单核细胞 。 但是，与其它细胞不同的是 ， DC 细胞具有诱导初发免疫反应的独特功能，例如，可以活化处女 T 细胞（ Naive T cell ）。 DC 细胞存在于外周淋巴组织中 ，已在血液和非淋巴器官中发现了不同类型的 DC 细胞，并被认为是淋巴组织中细胞的前体 。由于血液和组织中DC 细胞含量少 ，且缺乏特异的DC 标记物，所以 DC 细胞的研究非常困

2、难 。因此 ，关于 DC 细胞的了解主要来自于通过密度梯度离心、培养、和 / 或阴性选择富集后的DC 细胞的研究 。这些过程利用了 DC 细胞的密度和黏附特征 ，和在一定细胞因子条件下的选择性生长，或缺乏淋巴细胞 、单核细胞和粒细胞的系列标记物的表达。但是 ，这些方法中 DC 细胞的产率和纯度较低，且费时费力 。而且 ，这些操作可以影响细胞的功能，并且无法做 DC 细胞含量的定量分析 。最近的报告发现在活化DC 细胞和血液或淋巴细胞分离培养的DC 细胞表面CD83 和 CMRF-44 高表达 。CD83 和 CMRF-44 可以作为 DC 细胞的活化标志物 ，但在体内或未处理的细胞上没有特征性

3、表达，或表达水平很低 。 在对新鲜分离.下载可编辑 .的 DC 细胞的研究中 ，发现 IL-3R 在淋巴器官的 DC 细胞上有特异表达 。 从人类外周淋巴组织中分离的单个核细胞中主要是此类DC 细胞 。IL-3R （CD123 ）抗体可以用来进行免疫磁珠分选 ，从外周淋巴组织制备的单个核细胞样本中，将CD123+ DC 细胞进行 200 倍富集 。CD123 抗体还可以用来做免疫组化分析，特异识别滤泡外 T 细胞富集区的 CD123+ DC。在外周血中也有 CD123+DC 细胞，与以前所说的 CD11c- DC 细胞和 CD33dimCD14-CD16- DC细胞是同一类细胞。由于缺乏 DC

4、 特异性标记物 ，目前仍然不清楚DC 是否是自成一系的一类细胞 。DC 细胞既可以由成熟的外周血单核细胞生成，也可以由未分离的CD34+干祖细胞经 GM-CSF 和 TNF- 培养得到 。使用 CD123 抗体，发现有一群 CD34+DC 样幼稚细胞 。 这群细胞与CD34+ 干祖细胞的区别是可以发育成Langerhan细胞样 DC。 因此，根据 CD123 强染，可以识别出一类人类DC 细胞，它是不同组织间 DC 细胞的连接桥梁 。在外周淋巴组织中还发现另一个DC 亚群，与 CD123+ DC 不同的是 ，其表型为 CD11c+HLA-DR+LINdim/-。与 CD123+ DC 相反，这

5、群 DC 细胞位于生发中 心 。 在 血 中 也 含 有CD11c+HLA-DR+LINdim/-DC细 胞 ， 与CD33brightCD14dimCD16- DC细胞是同一类细胞 。由此可见 ，DC 系统由多种细胞类型构成，发育途径不一 。但是 ，目前对这些细胞的功能和可能的特殊性、在生理或病理条件下如何受调控等方面仍缺乏了解 。CD123+ DC 和 CD11c+ DC 细胞具有不同的表型 ，在淋巴器官中的位置也不同，提示它们可能有不同的功能。近年来的研究主要集中在使用DC 细胞进行抗肿瘤和抗感染治疗方面。不同报道证实 ，这有可能抑制肿瘤生长 。.下载可编辑 .使用这些新的 DC 标记物

6、建立起来的检测系统，可以帮助对新鲜外周血新鲜中的两类不同的 DC 细胞进行定量检测 ，同时可以加以分离 。实验方法采用三色或四色流式细胞仪分析，检测速度快 ，样本用量少 ，可以用来辅助研究在病理和生理条件下 ， DC 在免疫调控中作用 。检测原理和用具检测原理 ：本实验目的是从外周血中检测两种类型的DC 细胞：CD123+DC（ Anti-IL-3R + ）和 CD11c+ DC 。CD11c 和 CD123 并不是 DC 特异的标志物 。两类细胞均 HLA-DR 高表达，单核细胞 、淋巴细胞和 NK 细胞的系列标记物弱表达 。因此使用单一荧光标记的 LIN cocktail （LIN1 ）抗

7、体将 DC 细胞区分出来 。LIN1 抗体包括 CD3、 CD14、CD16、 CD19、 CD20 和 CD56 。另外，本实验还可以区分嗜碱粒细胞。嗜碱粒细胞的表型是：LIN1-CD123+HLA-DR-。使用 HLA-DR 可以区分嗜碱粒细胞和CD123+DC 细胞。细胞来源 ：样本使用EDTA、 ACD 或肝素钠抗凝全血，或分离的外周血单个核细胞（ PBMC）。样本采集后 24 小时内检测 。试剂：.下载可编辑 .1. 检测 DC 细胞用的 BDIS 荧光标记的单克隆抗体 。四色分析 ：LIN1 FITC：货号 340546 ，含有 CD3、CD14 、 CD16、 CD19、 CD2

8、0、CD56CD123 PE（Anti-IL-3R）：货号 340545Anti-HLA-DR PerCP ：货号 347364CD11c APC ：货号 340544Mouse IgG1 PE ：货号 349043Mouse IgG2a APC ：货号 340473三色分析 ：LIN1 FITC：货号340546 ，含有CD3、CD14 、 CD16、 CD19、 CD20、CD56CD123 PE（Anti-IL-3R）：货号 340545CD11c PE：货号 347637Anti-HLA-DR PerCP ：货号 347364Mouse IgG1 PE ：货号 349043Mouse

9、IgG2a PE ：货号 3490532. FACS Lysing Solution （10X）： FACS 溶血素，货号 349202 ，用去离子水 1：10 稀释3. 洗液：PBS缓冲液4. 1X PBS 配制的 1%多聚甲醛.下载可编辑 .设备用具 ：1. EDTA、 ACD 或肝素钠真空采血管2. 12 75mm FALCON 试管3. 振荡混匀器4. FACS流式细胞仪5. 离心机6. 微量加样器全血样本荧光抗体染色步骤：1. 按照下表在各管中加入适量抗体 ；FITCPEPerCPAPC4-Color四色分析Tube 1LIN1 20uLCD1235u （全血）Anti-HLA-DR

10、10uLCD11c10uL5uLTube 2LIN1 20uL（PBMC ）Anti-HLA-DR10uL.下载可编辑 .Mouse IgG1Mouse IgG2a3-Color三色分析Tube 1LIN1 20uLCD1235uL （全血）Anti-HLA-DR10uL10uLTube 2LIN1 20uL（PBMC ）Anti-HLA-DR10uLTube 3LIN1 20uLMouse IgG1Anti-HLA-DR10uLTube 4LIN1 20uLCD11c5uLAnti-HLA-DR10uLMouse IgG2a2. 每管加入 100uL 全血，振荡混匀 ，室温暗处反应 15 分

11、钟；3. 加入 2mL FACS 溶血剂，振荡混匀 ，室温暗处放置 10 分钟；4. 300xg 离心 5 分钟，弃上清；5. 振荡混匀 ，加入 1mL 洗液；6. 300xg 离心 5 分钟，弃上清；7. 振荡混匀 ，加入 300uL 1% 多聚甲醛 ；8. 2-8 C 暗处保存 ，24 小时内上机分析PBMC 样本荧光抗体染色步骤 ：1. 按照上表在各管中加入适量抗体 ；2. 每管加入 50uL 全血，振荡混匀 ，暗处冰浴反应 25 分钟；3. 轻轻混匀 ，加入 1mL 洗液；4. 300xg 离心 5 分钟，弃上清；.下载可编辑 .5. 轻轻混匀 ，加入 300uL 1% 多聚甲醛 ；6

12、. 2-8 C 暗处保存 ，24 小时内上机分析数据获取 ：1. 使用 CaliBRITE 微球，做 FACSComp，调整 PMT 电压和荧光补偿 ，检查仪器灵敏度 ；2. 上样：使用 CELLQuest 软件，获取 50,000 个细胞，用 FSC设阈值，排除碎片干扰 ；3. 使用 CELLQuest 软件分析结果数据分析 ：1.区分细胞和碎片 ：使用 FSC/SSC点图，画 R1，排除碎片和死细胞 ；.下载可编辑 .2.找 到LIN1弱 阳 性 和 阴 性 群 体 ： 使 用Anti-HLA-DR/LIN1点 图（ G1=R1 ），画 R2，圈定 LIN1 弱阳性和阴性细胞 ；.下载可编

13、辑 .3.区分外周血 DC 和嗜碱粒细胞 ：.下载可编辑 .在四色分析中 ，管 1 区分 DC 细胞和嗜碱粒细胞 ，管 2 是同型对照 。在三色分析中 ，管 1 和管 3 区分 DC 细胞和嗜碱粒细胞 ，管 2 和管 4 是同型对照。使用同型对照区分非特异染色在 Gate List 中定义 G3=R1 AND R2 。使用 Anti-HLA-DR/CD123点图和Anti-HLA-DR/CD11c点图（ G3=R1 AND R2），图中只显示 LIN1 弱阳性和阴性细胞 。 画 R3，圈定嗜碱粒细胞 （ Anti-HLA-DR-/CD123+）；画 R4，圈定 CD123+DC 细胞（Anti

14、-HLA-DR+/CD123+）；画 R5，圈定 CD11c+ 细胞（ Anti-HLA-DR+/CD11c+ ）；4.在 Gate List 中定义各门 ：G4（嗜碱粒细胞 ）=R1 AND R2 AND R3 ，G5（ CD123+ DC ）=R1 AND R2 AND R4， G6（CD11c+ DC ）=R1 AND.下载可编辑 .R2 AND R5 ，G7=R1 AND R2 AND（R3 OR R4 OR R5 ）；5.确认细胞群的准确性 ：下图显示了四色分析全血样本时的CD123+ DC 、CD11c+ DC 和嗜碱粒细胞各群的位置。.下载可编辑 .6. 分析各群细胞的百分含量 ：点击 Anti-HLA-DR/LIN1 （G1=R1 ）点图，做统计，得到各群细胞所占比例CD123+ DC%R1 AND R2 AND R4CD11c+ DC%R1 AND R2 AND R5嗜碱粒细胞 %R1 AND R2 AND R3在三色分析时 ，由两个