抑制麻风树溃疡病病原菌的土壤细菌筛选

1、抑制麻风树溃疡病病原菌的土壤细菌筛选 Screening of Soil Bacteria Inhibiting Canker of Jatropha curcas Guo Jianwei1 et al. (1 College of Life Science and Technology， Key Laboratory of Higher Quality and Efficient Cultivation and Security Control of Crops for Yunnan Province， Honghe University ， Mengzi 661100 ，China ) ：

2、63 strains rhizobacteria were isolated soil samples by streak platemethod， subquencely 4 nutrient competent strains controlling Botrosphaeria fuliginosa( Moug. et Nestl. )Ell. et Ev. were screened by tablet coating method. 4 strains above were G+ coccus. 麻风树( Jatropha curcas L. )别名黑皂树、膏桐、臭油桐、 木花生、小桐

3、子等，是大戟科( Euphorbiaceae )麻风树属落叶 灌木或小乔木，具有速生、耐旱、耐贫瘠、含油率高的特点，野 生条件下病虫害少；其茎、叶、树皮均有充沛的富含毒蛋白的白 色乳汁，可提取生物医药和生物农药；种壳、种子均含油，尤其 是种子含油率达31.1%47.2%,可加工生物柴油1-3。 据武建榕 2008 年首次报道，小桐子溃疡病最初发生于嫁接 的插穗上，病原菌为褐黑葡萄座腔菌 Botrosphaeria fuliginosa ( Moug. et Nestl. )Ell.et Ev. 和 Pseudoseptoria sp1。其症状表现为：初期插穗的地上部分枯死，后期干燥条件 下出现

4、许多半埋生于表皮层的黑褐色小点， 最终生根的插条枯死 4 。据吕相贤、何家柏、郭建伟调查，云南省双柏县、建水县、 蒙自县、 元阳县的小桐子种植林均发生了严重的茎溃疡病，经病 原菌分离、鉴定为褐黑葡萄座腔菌。目前，上述地区的小桐子属 于粗放式管理，每 3a 施药施肥一次，农药以多菌灵、代森锰锌 为主，防治效果不佳；此外，利用生物防治该病害的研究还鲜见 报道。 植物土壤细菌是指存在于植物根际土壤中的一类与植物互 利共生的细菌，对植物无可见危害。 1978 年 Burr 和 Schroth 首 先报道马铃薯根际土壤细菌， 随后国内外研究已经证实多种根际 土壤细菌的广泛存在， 目前报导最多的根际土壤细

5、菌菌株有假单 胞菌属(PseudomonaS、芽抱杆菌属(Bacillus )、农杆菌属 ( Agrobacterium )、埃文氏菌属( Eriwinia )、黄杆菌属 ( Flavobacterium )、巴斯德氏菌属( Pasteuria )等 5 。王丽 珍等从烟草根际土壤中分离出对烟草青枯病菌有拮抗活性的菌 株 348株，经复筛还发现：其中 29 株菌对赤星菌的抑菌带宽达 8.012.0mm 26株菌对黑胫菌的抑菌带宽达 9.014.0mm, 31 株菌对青枯菌的抑菌圈直径达 30.042.0mm6。因而，从小桐 子能源林土壤分离溃疡病拮抗性细菌， 具有一定的可行性和潜在 的应用价值

6、。 1 材料与方法 1.1 土样 小桐子根际土壤样品由何家柏和吕相贤于 2011 年 10 月采集自蒙自市草坝镇碧色寨麻疯树能源林；分别从沟底 （土壤较湿润、肥沃，腐殖质多）、坡上（土壤干燥、贫瘠，以 砂石为主）的林中 5 点取样，共 10 份土样。 1.2 病原菌活化 将分离自上述地点的褐黑葡萄座腔菌转接 在新鲜PDA培养基上，活化、备用。 1.3培养基PDA培养基：葡萄糖20g、马铃薯200g、琼脂 20g、蒸馏水1 OOOmL，pH自然（对峙培养筛选拮抗性细菌时加 20g蛋白胨）；NA培养基：牛肉膏3g、NaCI5g，蛋白胨10g、琼 脂 20g、蒸馏水 1 OOOmL, pH7.0 7

7、.2 7。 以上相应的固体或液体培养基以加琼脂与否为标准。 1.4 土壤细菌的分离、纯化 常规平板稀释培养法分离土壤 细菌并经划线法纯化 7 。 1.5 拮抗细菌的筛选与相对抑制率测定 采用 3 点接种法将 细菌与病原菌接种在加有蛋白胨的 PDA培养基上，28C恒温培养 514d,观察是否抑制病原菌；如抑制，则计算相对抑菌率 8。 相对抑菌率（ %） =（病原菌菌落半径 - 病原菌接种点到凹痕 的距离）/菌落半径X 100。 1.6 抑制菌株的形态及部分生理生化测定 对抑制病原菌的 细菌菌株进行革兰氏染色、荚膜染色、运动性测试、接触酶反应 等基本的形态学与生理生化测定 7 。 2 结果与分析

8、2.1 土壤细菌的分离 从 10 份土壤样品中分离出具有不同 菌落特征的细菌 63 株，说明麻风树根际土壤具有较为丰富的细 菌资源。 2.2 抑制病原菌的土壤细菌的筛选与相对抑菌 率 采用对峙生长法筛选出 4 株覆盖病原菌菌丝并阻止其进一步 生长的细菌，其菌落特征及抑菌作用见表 1 和图 1。 表1 对小桐子溃疡病病原菌具有抑制作用的 4个菌株特征 筛选菌株 &菌落色泽 &菌落特征 &相对抑菌率（% &WT4-仁&乳白色 &较湿润、光滑、透明 &21.4&WT2-1-2& 乳黄色 &干燥、边沿整齐、不透明 & 16.7&WT2-2-2-a&淡 乳黄色 &湿润、光滑、透明 &42.3 &WT2-

9、2-2-b&淡乳黄色 &湿润、光滑、不透明 & 38.6 & 注: A.WT2-2-2-a菌株对溃疡病病原菌抑制作用；B.WT2-1-2 菌株对溃疡病病原菌的抑制作用；C.病原菌 图 1 筛选菌株对溃疡病病原菌的抑制作用 2.3 抑制病原菌的土壤细菌的初步鉴定 如表 2所示，4株 细菌均为革兰氏阳性球菌，有荚膜，厌氧或兼性厌氧，都可以在 含5%NaCI的培养基上生长，具有一定的耐盐性。其中，WT4-1 接触酶反应阴性，在7%NaCI的培养基上不能生长，其余菌株接 触酶反应均为阳性， 耐7%NaC但不耐10%NaCJ WT2-1-2不具备 运动性，其余菌株沿穿刺线云雾状生长，均具有运动性。 表

10、2 拮抗菌株生理生化鉴定 菌株&革兰氏染色 &荚膜染色 &运动性 &厌氧性测定 &耐盐性试验 &接触酶反应 （3% H2O2） &2%NaCl &5%NaCl &7%NaCl &10%NaCl &WT4- &+,球菌 &+&+ &厌氧 &+&+ &- &- &- &WT2-1-2&+,球菌 &+ &-&兼性厌氧 &+&+&+ &- &+ &WT2-2-2-a&+,球菌 &+&+&兼性厌氧 &+&+&+ &- &+&WT2-2-2-b &+,球菌 &+&+&兼性厌氧 &+ &+ &+ &- &+ & 3 小结与讨论 3.1 土壤细菌的分离、纯化 本试验采用稀释涂布平板法从 小桐子能源林土壤样品中共分离到 63 株形态各异的土壤细菌， 说明小桐子根部土壤细菌具有丰富的多样性， 与前人关于植物根 际细菌普遍存在的观点是相符的。 3.2 抑制病原菌细菌的筛选 据报道，根际土壤微生物可通 过侵染位点的隔离与重寄生、 营养竞争、 拮抗作用等抑制植物病 原菌5， 6， 8-10 。本试验通过对峙生长法发现： 4株细菌虽然 不产生抑菌圈但会覆盖褐黑葡萄座腔菌菌丝并抑制其生长， 4 菌 株可能通过营养竞争作用抑制病原菌。 前人对土壤细菌的研究多数是对有关草本作物而非乔本植 物，虽然不能简单类比， 但显然本研究分离到的抑制病原