2742.探讨小麦硫转运蛋白基因RTPCR半定量检测体系的建立

1、 科技大学200 届毕业论文（设计）题目：探讨小麦硫转运蛋白基因rt-pcr半定量检测体系的建立姓 名: 专 业： 生物技术 学 院： 生命科学学院 指导教师： 完成日期： 2004年6月 小麦硫转运蛋白基因rt-pcr半定量检测体系的建立摘要 应用rt-pcr技术， 以tubulin为内参基因，小麦硫转运蛋白基因(sul)为检测基因，优化mg2+浓度、退火温度、循环次数、引物浓度和taq酶浓度，获得适宜的pcr反应参数，建立一个相对稳定、准确、特异的检测sul表达量的半定量体系，为进一步研究小麦硫转运蛋白表达调节机制奠定技术基础。关键词 小麦；tubulin；硫转运蛋白基因；rt-pcr；半

2、定量pcrto establish a method of semiquantitative polymerase chain reaction for detecting sul gene expressionabstract to establish a method of semiquantitative polymerase chain reaction for detecting sulphate transporter gene expression in wheat roots，we established a semiquantitative pcr by putting pr

3、imer of tubulin served as internal reference gene and primer of target gene in the same conditions and optimizing experiment parameters for pcr such as the concentration of mg2+ and cycle times etc. this method is usable to test the expressive level of sul gene in the wheat roots.key words：wheat；sul

4、phate transporter；rt-pcr；semiquantitative pcr前 言硫转运蛋白即硫酸盐转运蛋白，是一类主动运输硫酸根时所需的载体蛋白，也是植物体吸收、运输硫元素时的必需蛋白。硫元素是植物生长发育所必需的基本元素之一，它主要以so42-形式被植物吸收，通过硫转运蛋白进入植物体后，大部分同化为含硫氨基酸（如胱氨酸，半胱氨酸和蛋氨酸）和辅酶a硫胺素、生物素等维生素。因此硫转运蛋白植物原生质构成、能量固定、光合作用、固氮作用提高植物抗逆性等方面起到非常重要的作用。近年来，由于农业生产的提高增加了单位面积上养分的输出，不含硫或含硫少的肥料的使用量增加，作物秸秆还田少或作其他用

5、途，导致土壤缺硫现象越来越严重。硫缺乏已成为很多地区限制农业生产的重要因素之一，因而研究硫转运蛋白对提高小麦吸硫效率提高小麦品质与产量有着非常重要的意义。为了进一步探讨硫转运蛋白基因调控机制，有必要建立一种灵敏，简便，特异的半定量检测sul mrna表达的方法。逆转录多聚合酶链式反应(rtrcr)技术法是近年来发展出来的探讨基因转录水平的有效手段。因此本实验采用小麦为供试材料，以tubulin为内参基因，sul为检测基因，应用rt-pcr技术对小麦根部硫转运蛋白基因的表达进行半定量，建立一个特异、稳定的rt-pcr半定量检测体系，为进一步研究其表达调节机制奠定基础。一、材料与方法（一）实验材料

6、采用郑引1号小麦。 （二）主要试剂1、主要试剂 hogland营养液，trizol， m-mlv反转录酶，taq酶和pcr其他相关试剂，dna回收纯化试剂盒，0.5tbe，琼脂糖。2引物 （1）tubulin引物：根据nemoto等设计的扩增小麦tubulin基因片段的引物合成了上游引物和下游引物。 （2）sul引物：根据小麦硫转运蛋白基因序列tae512817分别自行设计和合成上游引物和下游引物。（3）反转录引物：oligo-d（t）。（三）主要仪器eppendorf 5415d型离心机，rt-200型 pcr扩增仪，dyy型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂），uvi凝胶成像系统。（四）实验方

7、法1材料准备 小麦种子用5% naclo消毒10min，吸胀24h，萌发48h后，在完全hogland营养液中光照培养至3叶期。2总rna提取 取小麦根0.1g，置液氮迅速研磨，加trizol 1000ml，室温静置5min。加氯仿200ml剧烈混匀，4下12000g 离心15min。吸取上层水相加400ml异丙醇，混匀室温静置10min，4下12000g 离心10min。小心弃上清，沿管壁加75乙醇1000ml洗涤管壁。加75乙醇1000ml涡悬，4下8000g离心10min。小心弃上清，短暂离心，吸取所有上清，沉淀于超净台下干燥，加20ml depc h2o溶解。 取5ml 总rna稀释1

8、00倍，测od值，检验其纯度。取5ml 总rna进行 1.0琼脂糖凝胶电泳，检测rna的完整性。3反转录反应体系为20ml，含总rna 2mg。 分别取5ml oligo-d（t）（100mg/l），总rna 3.64ml（见表1）h2o 3.36ml ，70水浴10min，冰骤冷5min。加5buffer 4ml，dntp 2ml，rnasin 1ml，m-mlv 1ml，37反应1h，95 5mim中止反应。4pcr扩增 参照标准pcr反应体系，优化mg2+浓度退火温度模板浓度循环次数引物浓度和taq酶浓度，获得适宜的实验参数，建立半定量pcr检测体系。5pcr产物的鉴定pcr扩增产物在0

9、.5tbe缓冲液中用1.0琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，电压60v，电泳40min，在紫外灯下观察电泳结果并切下特异dna片段，用天为时代dna回收纯化试剂盒进行回收，送上海生工公司测序。 二、结果与分析（一）小麦根系总rna提取结果 所提取的rna在0.5tbe缓冲液中经1.0琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图1，跑出三条清晰可见的带，分别为28s18s5srna，说明所提总rna完整性良好，降解少。 rna稀释100倍后用eppendorf紫外分光光度计测得的od值见表1，a260/a280的平均值在1.8-2.2之间，a260/a230也大于2.0, 说明所提总rna没有蛋白、多糖及酚类等

10、的污染，具有高纯度，达到试验要求（实验数据见表一）。按照此浓度计算出原管总rna浓度，约为2.087mg/ml。图1.小麦根系总rna琼脂糖电泳结果5s rrna18s rrna28s rrna 表1. 小麦根系总rna纯度和含量的测定浓度mg/mla260/a280a260/a230a230a260a280a320样品120.82.002.320.2240.5200.0270.000样品220.62.012.350.2200.5160.0250.000样品321.21.982.110.2510.5300.0250.001平均值20.872.002.260.2320.5220.0260.000

11、（二）pcr反应体系的建立1. 引物浓度的选择pcr扩增中引物浓度必须适宜，引物浓度过高会引起引物与模板之间的错配率增高，即非特异性产物增多，且可增加形成引物二聚体的机率；反之，则pcr扩增效率降低。但由于本实验所需要确定的参数过多，所以先将这一参数定为0.2m，即标准pcr体系引物浓度，以便确立其他参数。2. taq酶浓度的选择 taq酶浓度对pcr产物的影响至关重要，在20l pcr反应体系中，一般所需要的taq酶量为0.5-4u，根据扩增片段的长短及其复杂程度（g+c含量）不同而不同，使用过高taq酶可引起非特异性产物的增多，甚至有时只出现亮的通带而无任何扩增产物带。因此，要想达到理想的

12、pcr扩增效果，须确定taq酶的最适浓度。本实验进行25ml pcr反应开始采用 2.5u后又逐渐降低酶浓度，直至 0.75u时仍有清晰可辨的条带，所以将酶浓度确定为0.75u。3. mg2+浓度的选择 mg2+是taq酶的激活剂，mg2+的浓度直接影响pcr扩增的特异性和效率。mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，则可能催化非特异性的扩增。因此，每次当首次使用靶序列和引物的一种新组合时，尤其要将mg2+浓度选至最佳。在一般的pcr反应中，1.5-2.0 mmol/l是比较合适的。因此本实验设mg2+浓度分别为1.51.7 1.92.1 mmol/l四个对照，对tubulin和sul进行

13、pcr扩增，结果见图2。如图所示，835bp的片段即为sul的pcr产物，而579bp片段即为tubulin的pcr产物；1、2为mg2+浓度1.5mmol/l时的pcr产物，3、4为mg2+浓度1.7mmol/l时的pcr产物，5、6为mg2+浓度1.9mmol/l时的pcr产物，8、9为mg2+浓度2.1mmol/l时的pcr产物，7为dl2000的marker。当mg2+浓度为1.7 mmol/l时，tubulin和sul扩增所得条带均清晰可见，所以我们认为mg2+浓度为1.7 mmol/l是比较合适的。835bp579bp 9 8 7 6 5 4 3 2 12.1 mrker 1.9

14、1.7 1.5 （mmol/l） 图2. pcr反应体系中mg2+浓度的选择4. 退火温度的选择 退火温度是否合适是pcr扩增成败的关键。 退火温度的高低是基于引物解链和模板长度以及g+c含量来考虑的。退火温度决定并影响着引物对模板dna特异性识别位点的能力。因此温度尽可能高以提高扩增的特异性，但温度过高，较大的dna模板会导致更多对嘌呤和脱氨基敏感位点的出现，因此而导致pcr扩增失效；退火温度低，易出现扩增的非特异性带多且乱的情况。因此，本实验在参考引物tm值的前提下设一组对照以确定最佳的退火温度。当其他条件不变时，分别改变退火温度为5355575961，同时扩增tubulin和sul，结果

15、见图3。当退火温度为59时，tubulin和sul扩增所得条带均清晰可见，所以定体系退火温度为59。 500bp1000bp750bp835bp（sul片段）579bp(tubulin片段)750bp 53 55 57 59 61 （）图3. pcr反应体系中退火温度的选择（三）pcr半定量检测体系的建立pcr反应初始时产物呈指数积累，但经过一定的循环次数后由于dntpbuffer等反应原料的消耗，pcr产物不再呈指数累积而进入平台期，因此pcr产物量与循环次数也呈一定的曲线关系。为了避免平台效应的影响，合适的循环次数是pcr半定量方法的关键因素。本实验选择了两种方式来确定pcr进入平台期前的

16、循环次数。首先，通过计算同一扩增体系内产物量随着循环次数的增加而产生的变化情况，绘制动态曲线，来确定pcr反应随着时间的变化其扩增产物的动态变化过程。我们将前面确定的标准体系做了7个重复，然后分别在反应进行到15、20、25、30、35、40、45个循环时取出，同时跑电泳检测，结果如图4。当循环数少于20个时，pcr产物量很少；当循环数大于35个时，条带差异消失。经过凝胶成像系统检测后，扫描分析各条带的光密度值来表示各目的基因的扩增产量，统计多次扫描数值，以该统计值为纵坐标，循环次数为横坐标作图，如图5。我们可以看到，当循环数大于35个时，曲线趋于平缓，而在25-30次内，曲线为线性，为了确保

17、处于线性期内我们选用了30作为循环参数。 15 marker 20 25 30 35 40 45（循环）539bp(tubulin片段) 图4. pcr反应体系中循环次数的选择 图5. pcr反应体系中扩增产物与循环次数的关系接下来，为了进一步确定结果，我们在30循环数下扩增一组模板浓度梯度的样品，模板梯度是否能明显呈现来表明该循环次数是否已进入平台期。我们分别取同一cdna模板0.3l0.4l0.5l0.6l0.7l，作为一个模板浓度梯度，进行pcr扩增，结果如图6。539bp(tubulin片段) marker 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 (l模板)图6.循环次数为30时模板梯

18、度的pcr产物由上图可知，当循环数为30时，可以清楚地看到不同模板浓度的产物之间的差别，故初步可确定，至少在30循环时，本标准体系并未进入平台期，所以利用本体系在进行半定量检测样品时，选择30循环是合适的。最终确立的25ul pcr反应体系为（表2）：表2 25ul pcr反应体系dntp 0.1mm 10buffer 2.5ul taq 0.75u mg2+ 1.7mm p1 0.2um p2 0.2um cdna 0.5ul h2o 18.15ul最终确立的反应程序为： 94 2min 94 1min 59 1min 30cycles72 2min 72 10min 4 forever（四

19、）pcr产物的鉴定 pcr扩增产物在0.5tbe缓冲液中用1.0琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，分别跑出大约839bp和579bp的条带，与目的基因大小一致，经回收纯化后进行测序，其序列与tae512817的序列进行比对，只有少数碱基对存在差异，相似性达到97%以上。（结果见附录一）证明所扩增的产物为目的基因片段。 三、讨论 1、mrna的测定是分子生物学研究中一个常用的方法，传统的主要利用斑点杂交、northern blot等技术来完成。但是由于mrna含量少，且在转膜等操作过程中极易降解，加上本实验室rna的操作环境不是很好，都使得应用这些技术进行检测的可靠性降低。所以我们选择了近年来发

20、展的含内标化的rt-pcr半定量检测mrna的方法来完成该实验。含内标化的rt-pcr半定量检测简便、快速并能半定量因此比较适合本实验室进行。本实验利用tubulin为内参基因，用sul/tubulin的比值来确定在总rna中sul基因表达的相对含量。作为内参照的tubulin是一种维管束蛋白，其基因属保守性强的“管家基因”，tubulin mrna具有普遍而恒定表达的特性，设立内参照可减少因加样不准或rna定量时产生的误差。2、pcr扩增反应是酶促反应遵循酶促反应定律，开始的循环内样本dna呈指数累积，但经过一定的循环后，dna不再呈指数累积而进入平台期、为了避免平台效应的影响，合适的循环数

21、是pcr半定量方法的关键因素。3、本实验所用的每对引物所扩增的序列均至少跨越了两个内含子，所以直接根据pcr产物的大小即可看出有无基因组dna的污染。所以本实验除了为进一步半定量检测特定基因mrna含量建立了良好体系以外，同时建立起来的稳定扩增小麦tubulin基因cdna片段的pcr体系，也为实验室检测小麦mrna反转录反应成功与否提供了依据，并且该体系已经应用到了实验室检测小麦mrna反转录体系的实践中。4、本实验应用trizol试剂盒来作为提取小麦根系总rna的方法，得到了非常好的结果，与实验室其他方法相比，用trizol提取的小麦根组织总rna具有相对良好的完整性和纯度，且方法相对简单

22、快速。5、将mrna反转录成cdna是本实验的关键步骤，在反转录时可选用的引物有3种，即pcr引物中的反向引物、随机引物和oligo(dt)。本实验采用oligo(dt)，同时扩增tubulin与目的基因，使反转录更具高效性。6、我们的体系建立，基本克服了pcr的高度灵敏性及凝胶成像系统光密度扫描的不准确性对半定量造成的影响，但为了进一步保证我们半定量结果的正确性，我们还将同时进行样本rna的northern杂交，将二者的综合结果作为我们最终定量的结果。参考文献1 c. w迪芬巴赫，g.s德维克斯勒，主编(卢柏松、赵东，译) pcr技术实验指南北京：科学出版社，第2版199810152 j.萨

23、姆布鲁克 e.f弗里奇 t.曼尼阿蒂斯 分子克隆实验指南第3版m科学出版社3 张捷，定量和半定量pcr技术及其临床意义，北京医科大学学报，vol.31 no.5 oct.19994 李珊珊等，3种mrna检测方法比较，journal of henan medical university mar.2000 vol.35 no.2 5 董爱香等，小麦春化相关特异性pcr扩增体系的建立，山西农业大学学报 a 1000 162x（2000）03-0205-036 黄春等，rt-pcr半定量法检测人脐静脉内皮细胞t-pa和pai-1mrna表达，福建医科大学学报1999年第33卷第3期黄春等7 张继澍

24、主编，植物生理学，世界图书出版公司8 沈同，王镜严主编，生物化学，高等教育出版社，第三版9 leustek t and saito k (1999) sulfate transport and assimilation in plants. plant physiol 120: 637-643）10 dreyer i.,horeau c.,lemaillet g., zimmermann s., bush d.r., navarro a.r., schachtman d.p., spalding e.p., sentenac h.,gaber r.f. identification and c

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27、. and grignon, c. (1992) contrasting responses of sulphate and phosphate transporters in barley (hordeum vulgare l.) roots to protein modifying reagents and inhibition of protein synthesis. planta 187, 306-31414 hawkesford mj and smith fw (1997) molecular biology of higher plant sulphate transporter

28、s. in sulphur metabolism in higher plants (ed. cram wj, de kok, l j, stulen, i, brunold, c, and rennenberg, h.) backhuys publishers, leiden, the netherlands pp 13-25. 15 takahashi, n. sasakura, m. noji, k. saito, isolation and characterization of a cdna encoding a sulfate transporter from arabidopsi

29、s thaliana febs lett.392 (1996) 9599.16 h. takahashi, m. yamazaki, n. sasakura, a. watanabe, t. leustek, j. de almeida engler, g. engler, m. van montagu, k. saito, regulation of sulfur assimilation in higher plants: a sulfate transporter induced in sulfate-starved roots plays a central role in arabi

30、dopsis thaliana. proc. natl. acad. sci. usa 94 (1997) 1110211107.附录一：测序结果与产物序列的比对结果product (138) acttggcgaaaggattcagaattggtgtagtagctggaatggttgccctt seq1 (1) acttgncgaaagnattcagaattgntgtagtagctggaatggttgccctt seq2 (105) acttggcgaaaggattcagaattggtgtagtagctggaatggttgcccttconsensus (138) acttggcgaaaggat

31、tcagaattggtgtagtagctggaatggttgccctt 188 237 product (188) acggtaagcaatcgcaattggaagaacatttgctgccatgaaggactacc seq1 (51) acgg-aagcaatcgcaattggaagaccatttgctgccatgaaggactacc seq2 (155) acgg-aagcaatcgcaattggaagaacatttgctgccatgaaggactaccconsensus (188) acgg aagcaatcgcaattggaagaacatttgctgccatgaaggactacc 23

32、8 287 product (238) aaatagatgggaacaaagaaatggtagctctaggaaccatgaacattgtt seq1 (100) aaatagatgggaacaaagaaatggtagctctaggaaccatgaacattgtt seq2 (204) aaatagatgggaacaaagaaatggtagctctaggaaccatgaacattgttconsensus (238) aaatagatgggaacaaagaaatggtagctctaggaaccatgaacattgtt 288 337 product (288) ggctcaatgacttcatg

33、ctacgtggccacaggggttctttctcgcgatca seq1 (150) ggctcaatgacttcatgctacgtggccacagg-ttctttctcgcgatca seq2 (254) ggctcaatgacttcatgctacgtggccacagg-ttctttctcgcgatcaconsensus (288) ggctcaatgacttcatgctacgtggccacagg ttctttctcgcgatca 338 387 product (338) gcagtaaattacatggctggctgcaaaacagcagtatccaatgttgttat seq1 (

34、198) gcagtaaattacatggctggctgcaaaacagcagtatccaatgttgttat seq2 (302) gcagtaaattacatggctggctgcaaaacagcagtatccaatgttgttatconsensus (338) gcagtaaattacatggctggctgcaaaacagcagtatccaatgttgttat 388 437 product (388) ggcaattgtagtgatgctcacactgttgttgatcactccattgttcaagt seq1 (248) ggcaattgtagtgatgctcacactgttgttga

35、tcactccattgttcaagt seq2 (352) ggcaattgtagtgatgctcacactgttgttgatcactccattgttcaagtconsensus (388) ggcaattgtagtgatgctcacactgttgttgatcactccattgttcaagt 438 487 product (438) acacgcccaatgccattctagcttccatcatcataaatgcagtggttagc seq1 (298) acacgcccaatgccattctagcttccatcatcataaatgcagtggttagc seq2 (402) acacgcc

36、caatgccattctagcttccatcatcataaatgcagtggttagcconsensus (438) acacgcccaatgccattctagcttccatcatcataaatgcagtggttagc 488 537 product (488) ctagttgactatgagacggcgtaccttatctggaaggttgataaaatgga seq1 (348) ctagttgactatgagacggcgtaccttatctggaaggttgataaaatgga seq2 (452) ctagttgactatgagacggcgtaccttatctggaaggttgataa