3TL1细胞试验操作0001

1、实用标准文案 3T3-L1 细胞实验操作 3T3-L1 小鼠胚胎成纤维细胞（前脂肪） 培养基配制（准备 1L 高压过的超纯水） 1、DMEM 粉倒入 1L放旋子的烧杯，加灭菌水 1000ml ，盖锡纸磁力搅拌 40 分钟。 2、擦净，加入 3.7g Na 2CO3，盖锡纸磁力搅拌 10 分钟。 3、称 2.38g HEPES（4保存），盖锡纸磁力搅拌 20 分钟。 4、拿过滤嘴、针筒，用针筒吸配好的培养基，通过滤嘴过滤至高压过的100ml 瓶分装， 4保 存，用时加 10ml 血清配成 10%FBS 。 顺便先配诱导液： 配好的培养基分装入 100ml 瓶中， 90mlDMEM 。 准备好 F

2、BS、 IBMX 、DEX、insulin （ 2g/ml ） 先配两瓶 100ml 10%FBS ， A 液： IBMX 1ml + DEX 100 l + insulin 250 l 入 100ml 10%FBS B 液： insulin 250 l 入 100ml 10%FBS （先过滤） 细胞冻存 （全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌） 1、准备 DMEM （分装好的） * 1 瓶，50 ml 瓶 * 2 ，针，过滤器 * 1 ，DMSO 试剂，冻存管。 2、配冻存液（ 10ml ）： 按 5 ：4：1 比例 培养基 5ml ：血清 4ml ： DMSO 1ml ，混匀。 3、拿

3、出一个新的、 标记好用 针筒 把 过滤器 弄在 瓶口 用 针筒 吸 新配的冻存液， 把针头 摘 掉，经 过滤器 把 新配的冻存液 滤到新瓶。 文档 实用标准文案 4、PBS清洗细胞，加完盖盖子，加在壁上，然后吸弃，换枪头吸（一对一） 5、吸 胰酶 500 l（吸匀再用），放显微镜观察，消化完毕即吸弃（一对一） 6、大皿加入 23ml 冻存液，打圈吹散，分装 1ml 至冻存管，勿离心。 7、-4 30min ，-20 1h ，-80 2h ，最后液氮冻存。 一、细胞复苏 （准备 10%FBS 、晚上复苏） 1、将从液氮取出冻存管放入 37 恒温水箱搅拌解冻。 2、将细胞悬液软管吸取至培养皿中，加

4、入 56 ml10%FBS ，混匀 3、培养过夜后进行换液。 二、细胞传代 全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌） 10%FBS 即 90mlDMEM + 10ml 血清 半个月内用完 1、缓慢吸走旧培养基，换枪头，用 2ml DMEM 清洗，后吸弃。 2、加 500l 胰酶，在显微镜观察细胞形态，大部分消化成方形即可吸弃胰酶。 3、加入 2ml10%FBS ，打圈混匀，吸 1ml ，每皿大概 56 滴入新的培养皿（大皿 10 滴 1ml ）， 其余弃掉，后加 3ml10%FBS （大皿 8ml ），大概可 2 天传代。 4、换液时需缓慢吸弃旧培养基， DMEM 清洗细胞（注意换枪头杜绝污

5、染）后吸弃， 10%FBS 贴 壁加入 3ml 。 三、细胞接板 （全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌） 24 孔板： 560 l 细胞+6ml 10%FBS （12 个样） 【600 l 分化 1.2ml 增殖】 12 孔板： 1400 l 细胞+11ml 10%FBS 用 25ml 瓶一板对一瓶装 文档 实用标准文案 1、准备好 12 孔板、24 孔板各两份（两皿细胞）、 DMEM 、血清、 25ml 瓶 4个、软管。 2、配 10%FBS 90ml DMEM+10ml 血清 3、第一二瓶 各 6ml 10%FBS ，第三四瓶 各 11ml 10%FBS 4、吸弃旧培养基，加 2ml

6、 DMEM 摇晃清洗，吸弃， 500l 一皿细胞胰酶消化，显微镜观察细胞 分散开来即停止消化。 5、每皿加入 2ml 10%FBS ， 1ml 枪头打圈吹散。 6、将两皿细胞集中在一个培养皿，打圈吹散。 7、560 l 细胞分别加入一二瓶混匀， 1400 l细胞分别加入三四瓶混匀。 8、一二瓶对应加 500 l细胞进 24 孔板（加 12个孔）摇晃混匀， 三四瓶对应加 1ml 细胞进 12 孔板，摇晃混匀。放培养箱， 第二天进行转染 。 四、细胞转染 （无酶 EP 管、无酶小管、全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭 菌） 1、准 Opti-MEM ，灭菌水， mic （inhibitor ）

7、， NC ，Lipo3000 ，无酶 EP 管、无酶小管， 96 孔枪头板， 12 孔板、24 孔板各 2 板（工具照紫外） 2、NC 、mic （ inhibitor ）4 1500r 1.5min 离心 3、分装 Lipo3000 tube 管 150 l 一管（轻混）， mic （inhibitor ）、 NC 小管（换枪头加灭菌 水稀释，按说明书要求），标记好 4、分装 Opti-MEM 20ml 入瓶待用 5、计算好体系： （n 为样品数量， N 为总样品数量） Mic ： 45l + 600 l Opti-MEM （12孔板）- 3.75 l Mic * n + 50 lOpti-

8、MEM * n ； 22.5 l + 300 l Opti-MEM （24 孔板12 个样） -1.875 l Mic * n + 25 lOpti-MEM * n NC ： 45 l + 600 l Opti-MEM （12 孔板） - 3.75 l NC * n + 50 lOpti-MEM * n ； 文档 实用标准文案 22.5 l + 300 l Opti-MEM （24 孔板12 个样） -1.875 l NC * n + 25 lOpti-MEM * n LP： 84 l + 1200 l Opti-MEM （12 孔板） - 3.5 l LP * N + 50 lOpti-ME

9、M * N ； 36l + 600 l Opti-MEM （24孔板 12个样）-1.5 l LP * N + 25 lOpti-MEM * N Inhibitor ： 90l + 600 l Opti-MEM （12 孔板） - 7.5 l inh * n + 50 lOpti-MEM * n ； 45l + 300 l Opti-MEM （24孔板 12个样）- 3.75 l inh * n + 50 lOpti-MEM * n NC ： 90 l + 600 l Opti-MEM （12 孔板） - 7.5 l NC * n + 50 lOpti-MEM * n ； 45l + 300

10、l Opti-MEM （24孔板 12个样）- 3.75 l NC * n + 50 lOpti-MEM * n LP： 84 l + 1200 l Opti-MEM （12 孔板） - 3.5 l LP * N + 50 lOpti-MEM * N 36l + 600 l Opti-MEM （24孔板 12个样）-1.5 l LP * N + 25 lOpti-MEM * N 6、标记好 tube 管： mic 45 l + 600 l ；mic 22.5 l + 300 l； NC 45l + 600 l；NC 22.5 l + 300 l； LP 84l + 1200 l；LP 36l

11、+ 600 l。 in 90 l + 600 l ；in 45 l + 300 l； NC 90l + 600 l；NC 45 l + 300 l； LP 84l + 1200 l；LP 36l + 600 l。 注意： LP 需轻轻混匀，平均分至；平均分至，加后轻轻混匀。 静置 5min ，拿出接板后的 12 孔板、 24 孔板细胞观察。 7、将旧培养基吸弃， 12 孔板 每孔 1ml Opti-MEM + 100 l 转染液； 24 孔板 每孔 500l 文档 实用标准文案 Opti-MEM + 50 l 转染液（ 12 个孔） 8、加完晃匀， 6h 后换 10%FBS ，放培养箱 42h

12、 后换诱导液开始进行诱导 五、细胞诱导分化 （全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌） 配置储备液： IBMX（ 异丁基-甲基-黄嘌呤）: 分子量： 222.2g/mol （Sigma:I5879 ）-20 保存（难溶最后溶） 用二甲基亚砜 DMSO 配制 111.1mg/ml （0.5mol/L ）储存液 即：0.0115g IBMX + 940 ul ddH2O + 60 ul KOH 需用滤嘴过滤至新瓶子 终浓度为 0.5mmol/L 。（现配现用） DEX ： 分子量： 392.5g/mol （Sigma:D4902 ）-20 保存 用无水乙醇配制 1mg/ml（2.5mmol/L）

13、 储存液 即： 0.2mg DEX + 0.5ml 无水乙醇 终浓度为 1umol/L 。 Insulin ：25mg Insulin + 12.5ml HCl 溶解后过滤， PCR小管分装， 终浓度为 2ug/ml ，-20 保存。 1、待 3T3-L1 细胞在 24 孔板，毎板 100l 原细胞体积 +400 l 10% FBS 养 2 天长满，配制 诱 导液 诱导 3T3-L1 分化。（先配好 10%FBS 两瓶 100ml 的） 2、将旧培养液软管吸弃， PBS清洗，吸弃 PBS，加入配制好的诱导液 I 每孔 500l 于 24 孔板 中，培养 2 天。 3、将培养液软管吸弃， PBS

14、 清洗，吸弃 PBS，用 200ul 的枪头慢慢 加入配制好的诱导液 II 每孔 500l 于24 孔板中，培养 2 天。 文档 实用标准文案 4、将旧培养液软管吸弃， PBS清洗，吸弃 PBS，用 10%FBS 培养基培养 2 天。 5、细胞油红 O 染色的操作步骤： 、10% 中性甲醛的配制 材料：中性甲醛 （多聚甲醛 ） 密封瓶。 方法：称取 1g 中性甲醛粉末，加入 10ml 的超纯水中，密封，在 60 度水浴中过夜才能溶解。配 好的溶液 1 个星期内有效，最好 4 度保存。 、染色液的配制 材料：油红染料、棕色可密封瓶、异丙醇、针筒、滤嘴 方法：称取预先研磨粉碎的 0.5g 油红干粉

15、，溶于少量异丙醇中，然后加异丙醇至 100ml ，60 水浴溶解，棕色瓶密封 （或锡箔纸包裹避光 ）4保存，为储存液，可长期保存。用时取 6ml 加超 纯水 4ml 混匀，滤嘴过滤，稀释后数小时内用完。 1、吸弃培养基，用 PBS洗 2 遍，加入 10 的甲醛固定 30min1h （贴壁加），期间过滤油红 2、吸弃 10% 甲醛，用超纯水洗 2 遍，60% 异丙醇孵育 5min 3、吸弃 60% 异丙醇，均匀覆盖 oil red O 染 20min （6 孔板 2ml ，12 孔板 1ml ，24 孔板 500 l） 4 、吸弃 oil red O 后，用超纯水洗 25 遍，直至无污点 5、加

16、苏木精孵育细胞 1min ，吸弃苏木精，超纯水 25 遍 6、在细胞上加超纯水观察 若转染诱导成功，重新转染诱导一批细胞，进行一系列实验： 流式细胞术： （无酶枪头、 1.5mltube 管）注意用前灭菌 1、准备接板好的 12 孔板细胞、无酶枪头、 tube 管、 96 孔板。 2、摆好 12 个 tube 管，把原来 1ml 10%FBS 培养基吸至 tube 管，一组一枪头，吸 1ml PBS 文档 实用标准文案 清洗细胞（悬空加）。吸弃 PBS，一组一枪头，吸 100150 l 胰酶消化细胞（两排两排消化）， 显微镜观察第一个，吸弃胰酶，将原培养基从 tube 管一一对应吸回去 12

17、孔板，并吹匀细胞，轻 轻吹打。显微镜观察是否吹匀。 3、将消化并吹匀的细胞悬液吸回去 tube 管，一对一， 3000g 离心 5min 。 4、吸上清，留沉淀，大概留 50l，调 950l 吸弃上清。 5、悬空加入 4冷却的 PBS 1ml ，吹匀细胞， 3000g 离心 5min ，吸弃PBS（950 l+50 l两次 小心吸弃）。 6、加 300 l4 冷却的 PBS，吹匀细胞，避免成团。 7、缓慢悬空加入 700 l预冷的 70%无水乙醇，轻轻吹打均匀， 4保存（可一周）。 PI 染色： 1、准备好染色剂、 25ml 用锡箔纸包好的小瓶、 24 孔板、锡箔纸。 算好体系，多配一个样，加

18、入小瓶备用。现配现用，当天使用，4保存： 染色缓冲液（ n+1 ） * 0.5 ml -20 碘化丙啶染色液（ 20 x） （n+1 ）* 25 l 保存 RNase A （50 x）（n+1 ）* 10 l避光配制 Total（n+1 ）* 0.535 ml先加多后加少 容易混匀 2、将样品 5000g 离心 6 min ，沉淀细胞。小心吸除上清， 850 l+50 l 吸弃上清，预留 50l 左右的乙醇，以免吸走细胞。 3、加入 4 PBS，洗涤一次，离心 5000g 5 min ，沉淀细胞，小心吸除上清， 850 l+50 l 吸 弃上清，预留 50 l 左右的 PBS，以免吸走细胞。

19、4、轻轻弹击 tube 管底，使细胞分散，避免成团。 5、染色：每管样品中加入 0.535 ml 染色液，缓慢并充分重悬细胞， 37 避光（样品放入 24 孔 板用锡箔纸包好）温浴（放烘箱） 30min ，随后 4 或冰浴避光（样品垂直插入携带冰箱内冰） 文档 实用标准文案 存放。染色完成后宜 24h 内或当日完成检测，最好当天完成 CV 变异系数 CV 越低，峰值越好，越尖锐， 5% 左右效果较好，一般 10% 即可 提 RNA 的收样 （无酶枪头、 1.5mltube 管）注意用前灭菌 一组组分好不同枪头吸弃培养基，加入 500 l RNAiso 放 5min 。 标记好无酶 1.5mlt

20、ube 管，反复刮取、吸取细胞，将细胞移至 tube 管（ 不同组必须换枪 头，移完盖好）。 收样存放 -80 。 RNA 提取 （无酶枪头、 1.5mltube 管） 从-80 冰箱取出样品 静置 5min 后 12000r ，4 离心 10min 上清移至新的 1.5ml tube 管并标记好 1 加入 1 RNAiso Plus 等体积的 氯仿 （一般为 100 l） 震荡摇匀 5 室温静置 5min 12000r ，4 离心 15min 将上清转移至新的 tube 管并标记好 （ 150200 l） 加与上清液 等体积的 异丙醇，颠倒混匀 室温静置 10min 13000r ，4 离心

21、 10min 弃上清，向沉淀加入 1ml 的 75% 乙醇颠倒清洗沉淀 文档 实用标准文案 （离心时以管头朝内侧，则沉淀会附于管外侧，加入乙醇时从内侧，勿触沉淀，设阴性对照，即 横板为 dH 2O） 13000r ，4 离心 10min 弃上清，留沉淀 14000r ，4 离心 3min 吸走多余的 75% 乙醇 操作台风干 2min 各加入 8l DEPC 溶解 检测纯度： 打开软件按“ Acid ”按“否”选 RNA 每次吸 2l DEPC 先洗 3 遍，用滤纸弄干 用 2 l DEPC 每洗 1 次按 Blank ， Measure 洗到 0.5 为止 每个样品吸 2l ，Measure

22、 （每测完一次都要擦干） 保存（ Report ） RNA 稀释： （mRNA 定量 C 统一为 200 miRNA 定量 C 统一为 500 ） V 加 DEPC C测 V 剩 -V剩 C统 V 剩 = 6 l) 文档 实用标准文案 miRNA 定量 冰上操作、无酶离心管、无酶枪头） 取已稀释的 RT引物 5l，加入 45l RNA-Free 水。准备好 96 孔板，引物 RT，U6RT，放在 冰上 多配一个体系： miRNA-RT 引物 2 l（ n+1 ） U6 RT 2 l （n+1 ） RNA 不少于 1500ng （1500ng/C 统一=3l） 无菌 ddH 2O4 l（ n+1

23、 ） 总体积 11 l （n+1 ） 注意： RT引物用前稀释； 配体系时， RT引物和 U6RT 的量是固定的，模板和水的量是浮动的； 只在一个引物里面加内参； 下游引物是通用的； 不够的体系用无菌 ddH 2O 配平； 做完样品后保存至 -20 ； 如果接下来要做 miRNA 定量，则放在 4备用。 样品 1 样品 2 样品 3 样品 4 样品 5 样品 6 文档 实用标准文案 11l 体系 11l 体系 11l 体系 11l 体系 11l 体系 11l 体系 后对应加入模板（ 1500ng/C 统一= ）3l ，标记好，放入小型离心机，离心一下，再放入 PCR 仪 70 10min ，冰

24、上 2min （程序： 000 ） 放一管无酶 tube 管，多配一个体系，加入体系： 5 x buffer 5 l（ n+1 ） Mix 1 l （ n+1 ） 无菌 ddH 2O 8l（ n+1 ） 总体积： 14 l （n+1 ） 样品 1 样品 2 样品 3 样品 4 样品 5 样品 6 14 l 体系 14l 体系 14 l 体系 14 l 体系 14 l 体系 14l 体系 即总体积 ： 25 l 42 1h ， 37 15min ，98 5min （程序： 0000 ） 多配一个体系（ n+1 ），混匀，引物瞬时离心： 10 l（n+1 ） 0.8 l（n+1 ） 0.8 l（n

25、+1 ） SYBR F R（通用） 文档 实用标准文案 ddH 2O 6.4 l（n+1 ） 除去模板 2l，总体积 18l （n+1 ） 在冰上铺一次性手套，按 96 孔板在冰里，放好定量小管，标记好 每个小管对应加 18 l 体系，每个样都要有 U6 作为参照： cDNA 1 2 3 4 5 6 miR miR 体系 miR 体系 miR 体系 miR 体系 miR 体系 miR 体系 U6 U6 体系 U6 体系 U6 体系 U6 体系 U6 体系 U6 体系 盖上盖子，注意勿污染，用一次性手套隔着按紧定量管盖子，用镊子轻轻撬松定量小管，离心一 下。 去杨老师那，打开 Real-time

26、 机，桌面 miRNA pcrd ，然后 OK Next 选第三个 Open Lid ， 放样品，用一次性手套按一下，最后 Close Lid Star Run ，选择文件夹命名好保存，直到机器 绿灯亮起，登记好走人。 RT-PCR 冰上操作、无酶离心管、无酶枪头） 按 1：50 比例 加 1l gDNA Remover 入 50l 4 x DNA master mix 标记、加样、低速离心，加 2lRNA 进管， RNA 热变性 5min 65 ，冰上冷却 先配总 后分装 4 x DNA master mix 2l （固定） V mix 总 2 （ n 1） （根据样品而定） 0.5 dH2

27、O 4l VRNAC 统一 为 C统一 200 RNA 模板（样品） 2 l（0.5 g ） 文档 Total 8l VdH2O 8 - Vmix -VRNA6-VRNA VdH 2O总 VdH 2O （n 1） 实用标准文案 37 5min 冰上冷却 注 ：n 为 样品数量 上述反应液8 l 5xRTmixII2 l Total10 l 37 15min ，50 5min ，98 5min ，4 加 ddH 2O 稀释 40 l - 即稀释 5 倍（换枪头混匀， 4保存） 保存 mRNA 定量 1、反应体系 冰上操作、无酶离心管、无酶枪头） 体系 （n+2）*10 （ 避光 ） 各（ n+2

28、） * 0.8 （n+2） * 5.4 2、冰上操作，准备好各种规格的无酶枪头、 tube 管、引物、定量管 文档 实用标准文案 3、计算体系，多配 2 个 4、摆好定量管、 tube 管，标记好，先加体系（加中间，勿碰壁） 5、加样 一个 对应 一种 引物 6、加盖盖紧，离心 7、打开 Mrd_RT Star Run Open Lid 按顺序摆好 Close Lid Star Run 选 好文件夹，保存好，开始 Western Blot 细胞蛋白收样 （冰上操作、无酶 EP 管、无酶枪头） 1、n 个样， n*2 个 EP管（一式两份），实验前 2-3 分钟准备试剂（ RIPA、PI），打冰

29、。 2、把 要收的样 小心吸弃培 养基，注意一组一枪头。 3、1ml 冷冻的 PBS 清洗，吸弃，换组换枪头。 4、配蛋白裂解液：六孔板 每孔 150 l/ 十二孔板 每孔 100 l，多配一点， RIPA：PI=100 ：1。 5、按体系算好，加入，晃匀， 4冰箱孵育 30min ，打开 4离心机。 6、用 200 l 枪头吸匀刮取后加入至 tube 管， 12000 x/g （即 12000rcf ）离心 15min 7、移上清至新无酶小管（先吸上部分，下部分 10l枪头慢慢吸，维持 140 l150 l），收样完 后-80 保存。 蛋白浓度测定 1、BCA法 冰上操作、无酶 tube 管

30、、无酶枪头） BCA 试剂：取 50 份试剂 A 与 1 份试剂 B 混合均匀。此试剂可稳定一周。（需先计算体系，即 V所需 BCA 中的 B 试剂 N 样品量 8 个标准蛋白曲线孔 ） N * 200l； V所需BCA 中的A试剂 50* N*200l 51 51 文档 实用标准文案 标准蛋白质溶液：所买试剂浓度 5mg/ml ，用时稀释成 1mg/ml 的溶液。 （从 5mg/ml 的标准 蛋白溶液吸取 12.6 l加入 50.4 l 的RIPA 共配 63l 的1g/ l的标准蛋白溶液） 实验操作：绘制标准曲线 取 96 孔酶标板，按下表加入试剂。 标准曲线的绘制（表 1 ） 管号 1

31、2 3 4 5 6 7 8 标准蛋白溶液（ l ） 0 1 2 4 8 12 16 20 63l RIPA （l） 20 19 18 16 12 8 4 0 BCA 试剂（ l） 200 200 200 200 200 200 200 200 蛋白质浓度（ mg/ml ）0 0.025 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 上述试剂加完后， 准确吸取 20 l 样品 （10l 样品 +10 l RIPA ）溶液于酶标孔中，加入 BCA 试剂 200 l，轻摇，于 37保温 30-60min ，冷却至室温后， 以空白为对照，在酶标仪上 590nm 处 比色- 打开酶标仪，把 96 孔

32、板盖去掉放进酶标仪并合上，电脑打开 Gen5 ，点击 BCA.pot ，点 OK 即可导出 Excel 。 以牛血清白蛋白含量为横坐标， 以吸光值为纵坐标， 绘制标准曲线。 以标准曲线空白为对照， 根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量 保存 Excel 文件，选中测得标准蛋白溶液吸光度为横坐标，蛋白质浓度为纵坐标，插入 XY 散点图，右击表中的散点，添加趋势线，选择多项式，勾选显示公式以及 R 平均值。 将样品吸光值 copy 成列，将样品测得 吸光值 带入公式即可求得 C 所测样品稀释后浓度 ， 由于所测 20 l样品是 10l原样品+10 l PBS，即稀释 2倍，所以 C该样

33、品实际浓度= 2C所测 样品稀释后浓度，n该样品体系最小物质量=C 最小所测体系浓度 * V最小浓度体积 ，V所取体积 =n 该 样 品 体 系 最 小 物 质 量 /C 该 样 品 体 系 浓 度 ， 文档 实用标准文案 V 补加RIPA = V 最小体系浓度体积 -V 所取体积 VSDS=V 所取体积 /4 C稀释后最小浓度 *V 最小浓度体积 V 最小体系浓度体积 - C所测样品稀释后浓度 V 最小浓度体积 为测得最小浓度的样品剩下体积； C 所测样品稀释后浓度 为代入公式后的浓度 ） 蛋白变性 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液。例如 2X 或 5X 的

34、 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液。使用 5X 的 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同 体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。上样体积 ： 5X 的 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液 （Loading Buffer ） =4:1 ，离心一下，沸水煮 10 分钟，以充分变性蛋白。 流程图 制胶（ 1h ）电泳跑胶 （80V 40min 110V 140min& 90V 30min ） 转膜（ 80V 50min& ） TBST 清洗 5 次（每次 5min ）封闭（ 1.5h ） TBST 清洗 5 次（每次 5min ）附抗（内参： 小鼠抗-Actin ， 先摇床轻摇 3

35、0min ，再放冰箱 4 度过夜） TBST 清洗三次（ 5min/ 次）附抗（内参：山羊抗小 鼠，轻摇 1h ） TBST 清洗三次（ 5min/ 次）显影 物料及配制 1、电泳液：一包电泳粉 +1000ml 双蒸水（可回收使用） 2、10% 过硫酸铵： 1g 过硫酸铵 +10ml 双蒸水 3、转膜液：一包转膜粉 +800ml 双蒸水 +200ml 甲醇（可回收使用） 4、TBST 溶液： 50ml 20*TBS+950ml 双蒸水 +1ml 吐温 20 。（无需回收） 文档 实用标准文案 5、封闭液：购买 6、抗（内参）：将小鼠抗 -Actin ：稀释液 按 1:500 稀释待用， 4 度

36、保存。 抗（目的蛋白 58kDa ）：将 smad2 ：稀释液 按 1:1000 稀释待用， 4 度保存。 7、抗（内参）：将山羊抗小鼠：抗稀释液 按 1:5000 稀释代用， 4 度保存。 抗（目的蛋白 58kDa ）：将山羊抗兔：抗稀释液 按 1:5000 稀释待用， 4 度保存。 7、显影液：按说明书配制，避光可长期回收使用 8、定影液：按说明书配制，可长期回收使用 9、发光液：超敏发光液 A 液： B 液 =1:1 三、步骤 一）制胶 1、Tris- 甘氨酸 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 12% 分离胶溶液的配制 溶液成分 成分体积（共约 7.2ml ） 双蒸水 2.376ml

37、 30% 丙烯酰胺溶液 2.88ml 1.5mol/L Tris （ pH8.8 ） 1.8ml 10%SDS 72 l 10% 过硫酸氨 72 l TEMED （最后放，混匀） 4 l 2、Tris- 甘氨酸 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 5% 积层胶所用溶液 溶液成分 成分体积（共约 4.5ml ） 双蒸水 2.544ml 30% 丙烯酰胺溶液 0.74ml 1.5mol/L Tris （ pH6.8 ） 1.125ml 文档 实用标准文案 10%SDS 45 l 10% 过硫酸氨 45 l TEMED （最后放，混匀） 6l 3 、1）将规格 1.0mm 或其它规格的玻璃板固定好

38、。 2）依次将所需试剂加入烧杯中，加入TEMED 之后，混匀，用 1000ml 的移液枪沿玻璃板缝左右两边的 角交替加入分离胶溶液， 也可从左到右连续加入 （目的： 两种方法都可以使液面快速达到水平状态） 溶液加至玻璃板约 2/3 高度（ 即插梳子离水平面大约 1.5cm ），然后加双蒸水至满或溢出。室温放置 约 1h ，因受温度影响， 具体时间以胶凝固并且水平为标准 （可稍微倾斜玻璃板观察胶是否已经凝固） 如果胶凝固后未达到水平状态，需重做。 3 ）积层胶溶液的加入同上，使溶液至满或略低，将对应 1.00mm 规格的梳子嵌入积层胶溶液（同时按 压梳子两侧），室温（ 25 度左右）放置约 1h

39、 ，因受温度影响，具体时间以胶凝固并且水平为标（可 稍微倾斜玻璃板观察胶是否已经凝固）。 注： TEMED 的量要严格把握！若配制的胶过早凝固导致液面未达到水平状态，或者长时间不凝固，最可能 的原因是加入 TEMED 时出现了较大误差。天气较冷时（ 10 度左右），凝固时间会延长，可放恒温箱 中 37 度加速凝固。 二）跑胶 电泳液的配制（凝胶时配好） 溶液成分 成分体积（共约 1200ml ） 双蒸水 1200ml 甘氨酸 22.56g Tris Base 3.6g SDS 1.2g 文档 实用标准文案 1、将玻璃板放入电泳槽中，加入适量电泳液（要淹没玻璃板顶部）。在梳子两边同时用力，将其拔出。 2、在积层胶最左侧或最右侧的孔中加入5l 的 Mark ，然后在剩余孔中依次加入 30 l 蛋白提取液 （蓝 色）。加入的 Mark 和蛋白液的量可适当调整。加入时一定要仔细，视线要与孔保持水平，保证所 加蛋白提取液全部落入孔中，否则会影响后期含量测定。 3、开始跑胶 1 ）将电压调为 80V ，一直至蓝色接近玻璃板底部停止（约40min ，分离效果较好）。 2 ）将电压调为 80V ，当蓝色过了积层胶与分离胶的分界线，可将电压调为 110V ，一直至蓝色接 近玻璃板底部停止（ 140min ，分离效果不如上面方法好）。 三）转膜 转膜液的配制（电泳时配好，甲醇转膜前 3