基因工程笔记总结

1、 第二章 enzymes粘性末端连接效率高于平末端约 100 倍！解决方法：化平末端为粘性末端第四节 dna 连接酶 ligase一、dna 连接酶的发现二. 连接条件3. 平末端连接-同聚物加尾法（1）末端脱氧核苷酸转移酶功能：5至 3单链聚合必须是两条双链 dna。dna3端有游离的-oh，5端有一个磷酸基团（p）。 作用特点：单链；无模版需要能量。作用机理：三、连接反应的机理1、at p（nad+)提供激活的 amp。a: 用 5-特异的核酸外切酶处理 dna 分子，以便移去少数几个末端核苷酸, 获得 3-oh 的单链延伸末端。2、at p 与连接酶形成共价“连接酶-amp”复合物，并释

2、放出焦磷酸 ppi。b: 加入 datp/dttp 和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，dna 分子的 3-oh 末端将会出现单纯由 poly(da)和 poly(dt)组成的 dna 单链延伸。3、amp 与连接酶的赖氨酸 -氨基相连。4、amp 随后从连接酶的赖氨酸 -氨基转移到 dna一条链的 5端 p 上，形成“dna-腺苷酸”复合物。c: 获得 poly(da)和 poly(dt)尾巴，就会彼此连接起来。缺点：5、 3-oh 对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键， 当 poly(da)，poly(dt)不严格等长时,重组 dna 分子会释放出 amp。有缺口。ligase：只连“

3、nick 切口”，不连“gap 缺口”需要用 dna 聚合酶 i 填补，然后用 dna 连接酶连接最后的缺口。四. 两种 dna 连接酶4. 平末端连接1. e. coli dna ligase-衔接物连接法与接头连接法来源：e.coli(1) 平末端的衔接物连接法适用：粘性末端（peg 与高浓度一价阳离子存在可连平末端）衔接物的 5末端和待克隆的 dna 片段的 5 -末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。通过t4 dna 连接酶的作用使两者连接起来。用适当的限制酶消化具衔接物的 dna 分子和克隆载体分子。2. t4 ligase来源：t4 phage适用：粘性末端 及 平末端t4 vs.

4、e.coli(2) 平末端的接头连接法t4 dna ligase 制备容易，价格便宜，能进行各种类型连接反应，应用更广泛！五.ligase 的反应温度将具有某种限制性酶 (bamhi)粘性末端的典型 dna接头分子与平末端的 dna 片段连接后，后者变成具有粘性末端的 dna 分子。最佳温度：七.热稳定的dna 连接酶来自嗜热高温放线菌界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是4-15比较合适。热稳定的 dna 连接酶的应用：寡核苷酸连接测定法（ oligonucleotide ligation assay,ola）六. dna 分子连接的四种形式1. 粘性末端；2. 平末端；3. 平末端加

5、尾；4. 平末端加衔接物(linker)或接头(adaptor)(1)digestion and ligation连接酶链式反应（ligation chain reaction, lcr）1粘性末端连接寡核苷酸连接测定法的作用检测突变problem: (自我环化作用)解决方法：a、双酶切（两种内切酶）b、去磷酸寡核苷酸连接测定法的作用：检测突变。2.平末端连接1. 寡核苷酸连接测定法 （1）原理:末端补平两条寡聚核苷酸探针分子，同一种与之互补变性的靶dna 之间的杂交作用,这两条寡聚核苷酸探针分子在靶 dna 分子上的位置是彼此相邻的。末端标记及随机引物标记cdna 第二链合成（见 cdna

6、文库构建）dna 测序当他们同靶 dna 链是完全碱基配对时，便可以被连接酶连接起来。三. t4 dna 聚合酶1. t4 dna 聚合酶特点活性：结合点或靠近结合点处存在和靶 dna 错配的碱基两个探针之间不能形成磷酸二脂键。5533聚 合3外 切5外切低无第五节 dna 聚合酶 dna polymerase常用的 dna 聚合酶：高！1、大肠杆菌 dna 聚合酶2、大肠杆菌 dna 聚合酶的 klenow 大片段酶2.t4 dna 聚合酶活性的条件模版、引物、原料 dntp3、t4 dna 聚合酶4、t7 dna 聚合酶5、反转录酶等。3. t4 dna 聚合酶的“取代合成”法末端标记四.

7、 t7 dna 聚合酶1. t7 dna 聚合酶特点活性：一、大肠杆菌 dna 聚合酶dna 聚合酶特点5 3聚合高！活性： 5533聚合3外切5外切低5 3外切3 5外切无高有低2. t7 dna 聚合酶的应用合成：高活性，几 kb，不受 dna 二级结构的影响dna 聚合酶的应用放射性探针的标记(1)dna 聚合酶的两种特殊反应：标记：类似 t4 （取代合成）末端补平：类似 t4切口转移与链取代第六节核酸修饰酶一. 修饰的 t7 dna 聚合酶活性：(2) 切口转移法制备放射性 dna 分子杂交探针5 3聚 合更高(*3)！二、klenow 片段1、dna 聚合酶的 klenow 片段5

8、3外切3 5外切无无！活性：5533聚合3外 切5外切低修饰的 t7 dna 聚合酶的应用：无！低合成能力：更高、更快、更强！标记：重在“掺”与末端补平：2. klenow 片段的应用二.激酶(kinase) & 磷酸酶(phosphotase) 活性：降解单链核酸（dna 或 rna）为单核苷酸；降解双链核酸的单链区t4 多核苷酸激酶(1)特点(2) s1 核酸酶的应用-rna 分子的定位来源：t4 噬菌体 pset 基因编码；2. bal31 核酸酶活性：5-oh 加磷酸；bal31 核酸酶的三种活性：（1）单链核酸内切(2)t4 kinase 5末端标记的机理（2）双链核酸外切用酸性磷酸

9、酶处理使其脱磷酸，使 5oh 基国暴露，同多核苷酸激酶从r-p atp分子中转移来的r-p基团键合，实现末端标记。（3）双链切口对应链bal31 核酸酶主要用途：（1）诱发 dna 发生缺失突变（2）定位测定 dna 片断中限制性位点的分布(3) t4 多核苷酸激酶的应用a: 5末端标记b: 5末端磷酸化（3）研究超盘旋 dna 分子的二级结构磷酸酶3. 其他核酸酶(1)特点外切核酸酶（exonuclease ）：3至 5外切来源：细菌碱性磷酸酶（bacterial alkaline phosphotase，bap)，e.coli；小牛肠碱性磷酸酶（ calf intestinalalkali

10、ne phosphotase, ciap)，小牛肠。rna 酶(rnase)：切割 dna-rna 杂合链中的rna其他核酸酶:活性： 5-p 去磷酸外切核酸酶（exonuclease ）：3至 5外切(2) 磷酸酶作用机理催化核酸分子脱掉 5p，使 dna 分子 5p 转化成 5oh脱磷酸作用。dna 酶（dnase ）：随机切割 ss & dsdnarna 酶(rnase )：切割 dna-rna 杂合链中的这样产生的 5oh 末端，为随后在r-patp 和 t4rna多核苷酸激酶的作用下，可以加上放射性的标记。(3) 磷酸酶的应用第三章 techniques基因工程技术末端标记前处理防止

11、 dna 分子自身环化(4) bap 与 ciap 比较outline1、电泳热稳定性（65） bap：active ciap：30min 失活2、分子杂交3、转化与转染4、核酸测序第七节 核酸外切酶5、dna 扩增-pcr6、核酸-蛋白相互作用1. 核酸外（exonucleases）切酶定义:一类从多核苷酸链的一端开始按序催化降解核第一节 电泳苷酸的酶。原理：通过电场的作用使带电的大分子在电泳介质中运动。分类：单链的核酸外切酶双链的核酸外切酶目的：根据带电分子的分子量、电荷及构型分离不同的分子（依据不同的凝胶体系）。第八节 核酸内切酶1. s1 核酸酶电泳的分类：琼脂糖凝胶电泳（agaros

12、e gel electrophoresis），(1) 特点： 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ polyacrylamide gelelectrophoresis，page）agarose 与 page的不同：分辨率操作琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）应 用 ： rflp, aflp, dd-pcr, sequencing, primerextension, s1 mapping, rnase protection assayds-dna目 的：分离不同长度的 dna 片段a.确定 dna 片段的长度b.确定 dna 的有无与多少c.分析酶切产物第

13、二节 分子杂交一. 分子杂交概述(1) 定义凝胶电泳的原理: 略电泳步骤分子杂交（molecularhybridization）：不同来源的核酸单链之间或蛋白质亚基之间由于结构互补而发生的非共价键的结合。根据这一原理发展起来的各种技术统称为分子杂交技术。第一步：制胶第二步：样品制备第三步：点样(2) 用途第四步：跑电泳第五步：紫外灯下检测，拍照第六步：数据处理形成 dnadna(dnarna)杂种分子，可以用来a.检测特定生物体之间的亲缘关系。b.揭示核酸片段中某一特定基因的位置。缓冲体系：tae, ph 8.0, 50 mm - tris, acetate, edtac.对目的基因进行相对定

14、量。d.对特定蛋白质进行定性及定量分析tbe, ph 8.0, 50 mm - tris, borate, edta(3) 杂交的基本步骤影响迁移率的因素：凝胶的孔径以核酸分子杂交为例：凝胶电泳分离的 dna/rna吸印,转膜 (通过毛细管作用或电导作用)电压dna 片段长度及结构eb 的影响探针标记杂交分辨率影响因素：琼脂糖浓度检测(4). 种类缓冲液或样品的盐离子浓度核酸上样量southern: dna-dnanorthern: dna-rnawestern: pr-pr电压聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ poly-acrylamide gelelectrophoresis，pag

15、e ）二. southern blotting1. southern blotting范围：短片段分辨率：1bp(1)目的：检测特定 dna 序列。类型：(2)原理：电泳分离 dna，并将之转至尼龙膜上，以标记好的探针（dna）与之杂交。变性胶（长度）、非变性胶（长度、构型）变性胶：1、含尿素；2、dna 样品经甲酰胺与热处理； (3) 步骤 protocols3、电泳保持温度。a.基因组 dna 制备b.dna 酶切消化 c.琼脂糖凝胶电泳分离 dna 片断rpa有 northern blot 无法比拟的优势：d.碱变性，中和过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更加完全 。e.转移

16、 dna 到固相支持物(如，尼龙膜)rpa比 northern blot 灵敏 15150 倍，适合检测各种表达水平之基因 。f.杂交反应g.放射自显影rpa 通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一情况下的差异表达。h.数据分析2. other dna analyses一次 rpa就能完成 10 多次 northern blot 的工作，加快研究速度。（1）斑点杂交 (dot blotting)与狭线杂交 (slot blotting)主要缺点：（2）菌落与噬菌斑杂交rna 探针的制备麻烦。(1) dot blotting, slot blottlng:核酸酶消化时，酶量的控制困难，容易消

17、化过头， x片上什么都没有。将样品直接有规律地排列成点阵或线阵，然后进行杂交检测。多用于病原体基因检测，如微生物的基因 。(3) reverse northern blotting(2) 菌落与噬菌斑杂交（过程略）四. western blotting1. western blotting(1)目的：检测特异性蛋白质有无及表达量。三. northern blotting1. northern blotting(2)理论依据：抗原-抗体特异性相互作用。(1)目的：检测特定序列的 rna 的长度与丰度。(3)原理：电泳分离蛋白质，并将之转至膜上（blot)，(2)原理：电泳分离 rna，并将之转至

18、尼龙膜上（blot)， 以标记好的抗体（antibody）与之杂交。以标记好的探针（dna）与之杂交。“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗实验过程基本上同 southernsouthern blot 和 northern blot 区别：(4)免疫应答:略western blot显色的主要方法：a.底物化学发光 eclb.放射自显影1）rna 分子较小，不需进行限制性内切酶切割；2）在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使rna 变性，而不用 naoh，因为它会水解 rna 的 2-羟基基团；c.底物荧光 ecfd.底物 dab（二氨基联苯胺）呈色3）在转印后不能用低盐缓冲液洗膜，否则rna 会被

19、洗脱；底物化学发光 ecl4）在胶中不能加 eb，因它为影响 rna 与硝酸纤维素膜的结合；二抗用 hrp 标记，反应底物为过氧化物+鲁米诺，底物遇到 hrp 发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。5）操作均应避免 rnase 的污染。western analysis(2) ribonuclease protection assay 过程：rna 和探针在液体混合物中杂交.2.分子杂交技术与细胞学的结合(1)原位杂交（in situ hybridization）与荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization, fish）未杂交上的 rna 和探针被核酸酶降解，这

20、种核酸酶只识别单链 rna。原理：标记的探针与在细胞原位的 dna 分子杂交，通过显色反应其相应 dna 在细胞染色体中的具体位置。杂交后的探针和 rna 复合体通过琼脂糖凝胶电泳分离。(2)免疫组织化学（immunohistochemistry）转膜，放射自显影。 (5)脂质体（lipofectin）第三节由人工合成磷脂类双分子层的脂质体包埋 dna，然 后进行脂质体与细胞膜的融合（内吞），将外源dna 导入细胞。外源核酸导入细胞的方法一.概述二.大肠杆菌的转化三.植物的转化(6)反转录病毒具有感染性的病毒颗粒，可以介导目的基因转染到分裂细胞。一.概述1. 转化/转染二.大肠杆菌的转化（1）

21、转化(transformation)是将外源 dna 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段 ,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。1. 成功转化的必要条件(1)感受态（competence）：a: 细菌能够获取外源 dna 的状态。(2)基因转移的目的b: 特定蛋白与 dna 结合形成可以抵御核酸酶的复合物。扩增重组 dna功能表达(2) 复制子（replicon）外源 dna 稳定存在。(3) 转化与转染转染（transfection)：当细菌的转化过程中吸收的外源dna 是病毒 dna 时就应该称此过程为转染。(3) 外源 dna 的功能表达。2.感受态

22、大肠杆菌的制备3. 大肠杆菌的转化-以 pglo 质粒为例对于真核生物，转染就是原核生物中转化的同义词，而转化指正常细胞转变为癌下表过程。三. 植物的转化1.应用2.外源基因导入的方法2.转化的方法3.农杆菌介导的转化(1) 热休克法（heat-shock)影响热休克法转化效率的因素dna：构型、纯度、浓度1.应用受体菌：r/m 体系缺陷型；生理状态及成活率a.提高植物的农业价值和园艺价值环境：温度、ph、离子浓度(2) 电穿孔法 (electroporation)转化的原理与技术：b.生物反应器（蛋白/次生代谢产物）c.研究基因在发育、代谢途径中的作用高压电脉冲作用使细胞膜上出现小孔。2.转

23、化的方法电穿孔法影响因素：植物遗传转化技术可分为两大类：电压脉冲持续时间一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、peg 介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。细胞类型(3)微弹轰击法(gene-gun)用压缩气体（氦氮）动力，产生一种冷的气体冲击波进入轰击室，将包裹在金属颗粒表面的外源 dna随金属颗粒穿过细胞壁，细胞膜，细胞质等，层层到达细胞核。另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。(4)显微注射(microinjection)用微

24、吸管吸取供体溶液，在显微镜下准确地插入受体细胞核中的直接转移方法。3. 农杆菌介导的转化 (一)农杆菌的 ti 质粒与 t-dna的整合机制1. pcr 的定义酚类-（启动）-ti 质料上的 vir 基因-（表达）-vir基因产物-（切断）-质料上的 t-dna 单链；切下来的单链 t-dna 与操纵子基因产物形成复合物，转化植物根部细胞。pcr 技术是体外酶促合成特异 dna 片段的一种方法,为最常用的分子生物学技术之一。2. pcr 的发明t-dna上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱，是农杆菌生长必

25、需的物质。mullis 由此获得 1993 年诺贝尔化学奖。3. pcr 技术的原理在微量离心管中 ,加入适量的缓冲液 , 微量的模板（二）ti 质粒转化植物细胞的战略dna,四种脱氧单核苷酸 ,耐热性多聚酶 ,一对合成的为利用农杆菌的 ti 质粒，发展了共整合系统和双元载体系统，避免了在大的 ti 质粒上进行分子重组操作的困难。dna 引物。通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环。每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过 30 次循环,最终使基因放共整合系统原理:大了数百万倍。部分 t-dna片段克隆在大肠杆菌质粒上，含有 e.coli的选择标记和植物选择标记 k

26、mr(卡那霉素抗性)。4. pcr 技术的特点高度的灵敏性特异性在 e.coli 中, 将外源基因和带有部分 t-dna片断的质粒重组，筛选重组子；将重组质粒转化到农杆菌中，质粒与 ti 质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到 ti 质粒上，侵染植物细胞。操作简便易行用途广泛5. 引物设计长度结构（避免内部形成二级结构&有互补序列）植物细胞转化的双元系统gc 含量主要包括两个部分：6. pcr 反应的条件及过程(1) 具备的条件卸甲 ti 质粒，由于缺失了 t-dna 区域，丧失了致瘤作用，主要是提供 vir 基因功能，激活处于反式位置上的 t-dna的转移。总体积25-缓冲液原料引物

27、微型 ti 质粒(mini-ti plasmid)，它在 tdna 左右边界序列之间提供植株选择标记如 nptii 基因以及大肠杆菌选择标记 lac z 基因等。bufferdntp双元载体系统的构建的原理：是ti 质粒上的 vir 基因可以反式激活 tdna 的转移。primerdna 分子taq酶模板穿梭质粒定义：一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，可以在两种不同类群中存在复制。dna 聚合酶(2) 反应过程变性：退火：第四节 基因扩增技术-pcrpcr 的定义延伸：(3) pcr 产物检测pcr 技术的发明7. 影响 pcr 的因素（）taq dna polymerase（）模

28、板的浓度（）dntppcr 的原理pcr 的反应体系和方法pcr 的类型和应用 （）mg2+浓度（）变性的时间sanger 测序法（）退火的温度与时间（）延伸的温度与时间8. pcr 技术的分类sanger1977 年发明, 1980年 nobel prize化学奖1. 原理传统 pcr 只扩增两个引物质之间的已知序列（1）在 pcr 反应中，以 dna 一条链为模板，按碱基互补配对的原则，复制链在引物3端以5-3方向延伸。（）反向 pcr把线性 dna 模板转变成环形分子。（2）底物是 2-脱氧 dntp 和一定量 2, 3 双脱氧 ddntp(脱氧核糖的 3位置缺少一个羟基)。选择一个在已

29、知序列中没有，而其两侧都存在的限制性内切酶位点。用相应的限制性内切酶酶解后，将酶切的片段在连接酶的作用下环化，使得已知序列位于（3）2，3双脱氧 ddntp 会使复制反应终止。环状分子上。根据已知序列的两端序列设计两个引物， （4）链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞以环状分子为模板进行 pcr，就可以扩增出已知序列两侧的未知序列。争，使产物是一系列的核苷酸链。（）反转录 pcr（rt-pcr)（5）在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddntp，结果将产生 4 组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的 a、c、g 或 t 位置。以 rna 为模板, 经逆转录获得与 rna 互补的 dna链(

30、即 cdna)，然后以 cdna 链为模板进行的 pcr 反应。2. 过程a. 引物进行放射性标记。（）梯度 pcr (gradient pcr )b. 四种合成反应分别在不同的管中进行，依次分别加入 ddgtp，ddatp, ddctp, ddttp。（）实时荧光定量 pcrct 值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。c. 在第一个管中，dna 分子的合成过程中会有 g 掺入，每一个模板c点对应的位点都有几率插入ddgtp，只要插入 ddgtp， dna 分子延伸就会停止，而且这一反应是随机发生的。因此就会形成一系列末端是ddgtp 的 dna 分子。ct 值与起始模板每

31、个模板的 ct 值与其起始拷贝数的对数是线性关系;sybr 荧光染料d. 同样的过程也会发生在另外 3 个管里。内嵌染料(sybr-greenl)：sybr-greenl，能与双链 dna 特异结合，而不与单链dna 结合。未与双链 dna 结合时荧光信号强度较低，e. 反应后的样品进行电泳并放射自显影分析。而当sg与双链dna结合，荧光信号强度极大的增强。 3步骤a. 测序胶的制备taqman 荧光探针：b. 模板 dna 的制备, 纯化c. pcr 扩增pcr 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针；探针两端分别标记报告荧光基团和淬灭荧光基团；d. 点样，跑胶e. 序列分析dn

32、a 自动化测序第五节 dna 测序与合成一. dna 测序过程：1、准备模板，引物，tap 酶，dntp 和少量用不同标记物标记的四种 ddntp；目的：基因组序列测定2、用 sanger 测序法进行 pcr 反应，体系中会产生各种长度不同的dna 片段（各片段间只相差一个碱基）；检查基因多态性确定新克隆的 dnas 序列证实需要确认的突变3、电泳分离； 4、自动化读取胶上的条带信号。测；5应用：可用于检测 dna 结合蛋白&rna 结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体来检测特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。maxam-gilbert 化学修饰法1. 原理6. 优,缺点用化学试剂处理末端放射

33、性标记的 dna 片断，造成碱基的特异性切割，由此产生一组具有各种不同长度的 dna 链的反应混合物，经凝胶电泳大小分离和反射子显影后，便可以根据 x 光片底板上所显现的相应谱带，直接读出待测 dna 片段的核苷酸顺序。优点：简单、快捷缺点：确定准确结合部位比较麻烦三. dnase i 足迹实验（可以准确确定结合部位）1. 原理二. dna 片段的化学合成常用方法-亚磷酰胺三酯法如果某个蛋白质已经与 dna 的特定区段相结合，它就会保证该区段 dna 免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带。第六节 dna 与蛋白质相互作用2. 过程 用

34、32p 标记 dna 双链末端，并用 re 切去一端；得到一条单链标记的 dna 双链分子，概述凝胶阻滞实验dnase i 足迹实验dms 足迹实验染色质免疫共沉淀蛋白质与蛋白质相互作用 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； 加入适量dnasei或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使dna链发生断裂。沉淀 dna（包括与 dna 相结合的蛋白质）；进行 dna 凝胶分析。一.概述1. dna-蛋白质互作的意义:a.dna 的复制与重组四. dms 足迹实验1. 原理b.基因转录调控与转录后修饰2.dna-蛋白质互作的研究方法(1) 凝胶阻滞实验硫酸二甲酯（dimethylsulfate，dms）：甲基化鸟

35、嘌呤六氢吡啶：切割甲基化的鸟嘌呤(2) dnase i 足迹实验(3) dms 足迹实验dna 特异序列结合蛋白：阻止甲基化，阻止切割(4) 染色质免疫共沉淀二. 凝胶阻滞实验适量 dms 处理完整的游离细胞，使染色质中的 g 残基甲基化，提取 dna 并加入六氢吡啶切割 dna 链。与对照的裸露 dna 经甲基化处理后形成的梯度相对照，就能发现 dna 链上的蛋白质结合区。1. 原理蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。2. 步骤a.标记放射性探针并提取细胞核蛋白；五. 染色质免疫共沉淀(chip)1.原理b.提取物与探

36、针进行温育，形成蛋白质-dna 复合体； 活细胞状态下固定蛋白质dna 复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段;c.将混合物加样到聚丙烯酰胺凝胶上，通过电泳将游离的探针和已与蛋白结合的探针分离；然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的 dna 片段;d.放射自显影成像分析对游离型和结合型探针进行检通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与 dna 相互作用的信息;after chippcrc.克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与 bd基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的cdna 文库与 ad 基因构建成“猎物”基因库，共转化酵母细胞。south

37、ernsequencing第七节. 蛋白质与蛋白质相互作用1. gst 融合蛋白的 pulldown 实验第四章 基因的分离概述（1）原理定位克隆技术细菌表达的谷胱甘肽 s转移酶（gst）融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性蛋白结合。基因文库的构建与筛选差异表达基因的分析方法cdna 芯片技术根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀 gst 融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。第一节 概述一. 基因克隆（gene cloning）1. 定义：目的基因的分离与鉴定2. 免疫共沉淀（1）原理当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质 x 的抗体免疫沉淀

38、 x，那么与 x 在体内结合的蛋白质 y 也能沉淀下来。2. 过程：1)、选材与 dna 分子的片段化2)、目的片段与载体的连接3)、外源重组分子的导入4)、重组分子的筛选3 酵母双杂交系统（1）原理二. 目的基因的分离编码产物已知的基因编码产物未知的基因将编码某一蛋白x 的 dna 序列与 dna 结合域 bd 的编码序列融合形成一个杂交体；将编码另一蛋白y 的 dna 序列与 dna 激活域 ad 的1.编码产物已知的基因的分离编码序列融合形成另一个杂交体；通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物；当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞上游有对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码

39、该蛋白质dna 结合位点的报告基因），若 x 和 y 没有相互作用， 的基因序列；则单独不能激活报告基因的转录；若 x 和 y 可相互作通过寡聚核苷酸探针或 pcr 制备的探针对文库筛选用，则使 bd 和 ad 靠近形成一个有效的转录激活子， 分离目的基因。激活报告基因的转录。通过检测报告基因的转录来研究蛋白质 x 和 y 的相互作用。2. 编码产物未知的基因的分离定位克隆技术 (positional cloning)（2）筛选在缺少亮氨酸（leu）和色氨酸（trp）的培养基上筛选蛋白 a 和蛋白 b 能相互作用的双载体转化子。差异表达基因的分析方法（ analysis of differen

40、tiallyexpressed genes）cdna 芯片技术 (cdna microarray)（3）用途a.已知蛋白之间相互作用的检测。基因标鉴法 (transposon tagging)b.蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，可检测其功能域或关键氨基酸。定位克隆技术 首先基因定位，然后以紧密连锁的分子标记为起点，通过筛选基因文库，染色体步移逐步向目标基因靠近， 1). 限制性片段长度多态性（rflp）最终克隆目标基因。(1) 技术原理：dna 序列的变化引起酶切位点的改变，差异表达基因的分析方法-差别显示技术(differentialexpression)从而使两

41、个酶切位点间的 dna 片段长度发生变化。以 mrna 为起始材料，利用rt-pcr技术，对差异显示的基因带纹进行回收后作探针，在cdna 或基因组dna 文库中筛选新的基因。基础：酶切(2) 优，缺点优势：共显性，有利选择隐性基因；rflp 标记之间相互独立，互不干扰cdna 芯片技术缺陷：信息含量较低，费用昂贵，操作复杂，不适用于分析样本量较大的群体(3) 应用基因标鉴法第二节 定位克隆技术 positional cloning构建基因组连锁图谱亲缘关系鉴定一.定位克隆步骤品种鉴定a 将目标基因定位在高密度的分子标记连锁群上(一对紧密连锁的分子标记)2).随机扩增多态性(rapd)b 构建

42、 yac/bac 基因组文库技术原理：c 利用紧密连锁的两个分子标记作探针 , 筛选基因组文库，构建包含目的基因的物理图谱以短核苷酸为随机引物(10-12bp)，以 dna 为模板合成多态性 dna 片段。(3) 优，缺点d 筛选含连锁标记的 yac克隆，通过染色体移位将克隆排序获得目标基因的 dna 片段优势：技术简单，检测速度快；引物序列通用性强，无需根据物种特异性分别设计引物；成本较低，所需dna 量较少e 通过转化和功能互补试验证实基因所在的 dna 片缺陷：显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子；共迁移；重复性差段。二. 分子标记1. 定义3）. 扩增片段长度多态性（aflp）dna 分子

43、标记（dna molecular marker）是指可遗传并可检测的 dna 序列，以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础，是 dna 水平遗传变异的直接反映。技术原理：先进行 pcr 扩增，再进行酶切，跑电泳。优势：rapd 相比：假阳性率降低，重复性好；rflp相比：操作简单2. 特 征基因组 dna 水平缺陷：基因组 dna 质量要求高，成本高，多为显性标记 。可遗传可与基因-表型连锁3.技术方法4）.简单重复序列与dna指纹技术（ssr & dna fingerprinting ）限制性片段长度多态性（ restriction fragment lengthpolymorphism，rf

44、lp）特性：a高度的特异性：b稳定的遗传性：随机扩增多态性（random amplified polymorphismdna，rapd）c体细胞稳定性：扩 增 片 段长 度多 态 性（ amplified fragment lengthpolymorphism，aflp）简单重复序列（simple sequence repeats，ssr）第三节 基因文库的构建与筛选基因文库的基本概念dna 指纹技术（dna finger printing）基因文库的构建程序基因组文库重组克隆的排序 1、 基因文库定义：mrna 水平的 aflp从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。根据构建方法的不同基因文3消减杂交（subtractive hybridi