玻璃粘连蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化影响

1、文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编借，有帮助欢迎下载支持. 玻璃粘连蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞成骨 分化影响 作者：王明明叶发刚葛银林 【摘要】目的体外分离纯化培养大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC), 研究玻璃粘连蛋白(VX)在rMSC向成骨方向分化过程中的作用。方法 贴壁分离培养法分离纯化rMSC,观察第1、3、5、8、10代细胞的增 殖情况，并绘制出生长曲线。选第3代细胞用以VX包被的培养板培养, 每4 d检测碱性磷酸酶活性及钙结节的形成。结果 经贴壁筛选法分离 的rMSC生长曲线呈S形，第3、4、5代细胞排列具有典型的漩涡状结 构；细胞表达CD44、CD90,而不表达CD3

2、4o用以VN包被的培养板培 养12d,碱性磷酸酶染色呈阳性，硝酸银染色显示有钙结节形成。结 论V有诱导rMSC向成骨方向分化的作用。 【关键词】骨髓;间质干细胞；玻璃粘连蛋白；细胞分化 ABSTRACT Objective To isolate, purify and cultivate the rat mesenehymal stem cells (rMSCs) in vitro, and study the effect of vitronectin (VN) on osteogenic differentiation of rMSCs Methods rMSCs were isolate

3、d and purified by wall adhesion culture procedure in vitro. The growth curve of cell proliferation was obtained based on the observation of the proliferation status of 1st, 3rd, 5th, Sth, and 10th generation The cells of the 3rd generation were cultured in culture plates coated by VN, and calci拟fyin

4、g nodule and alkaline phosphatase 1文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑. 文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编借，有帮助欢迎下载支持. （ALP） acti vity checked every four days Results The rMSCs grow th curve appearred as S form, and 3rd,4th and 5th generation manifested as typical whirlpool structure. These cells expressed CD44 and CD90

5、, but not CD34. The cells cultured for 12 days in cultureplates and coated with VN showed positive ALP expression and calcifying nodules Conclusion Vitronectin pocesses a potential of inducing RMSC towards osteogenic differentiation. KEY WORDS bone marrow; mesenchymal stem cells; vitronectin; cell d

6、ifferentiation 骨髓间充质干细胞（MSC）为骨髓中一群多能干细胞，在不同的 因素诱导下可以分化为不同的细胞。启动MSC分化的确切因素尚不十 分清楚，周围环境中某些可溶性诱导因子己被成功鉴定，而周围不可 溶性成分对成骨诱导的作用相对关注较少。本实验主要研究构成细胞 外基质主要成分的玻璃粘连蛋白（VN）在MSC向成骨分化过程中的作 用，以探讨MSC成骨分化的确切因素。 1材料和方法 1. 1实验材料 Wistar大鼠，2月龄，由青岛市药品检验所提供。VN （武汉博士 德生物工程有限公司）丄拟DMEM低糖培养基（GIBCO公司），胎牛血清 （兰州民海生物工程有限公司），胰蛋白酶（SIG

7、MA公司），羊抗大鼠 CD34拟FITC、CD44拟FITC、CD90拟FITC （北京中山生物公司）。 1.2实验方法 1.2.1大鼠骨髓间充质干细胞其他管分别加羊 抗大鼠CD34拟FITC、CD44拟FITC、CD90拟FITC以及细胞与荧光素拟共 辘抗体抗CD29、CD34、CD90,在黑暗中孵化15 min。流式细胞仪检测 细胞表面抗原表达情况。 1. 2. 4 rMSC与VN共培养及相关指标检测 在rMSC传代3次后,将指数生长期细胞用L拟DMEM调细胞的 密度为3.0X103/cm2,接种于用纯化的VN包被的24孔培养板中，以 成骨诱导液为阳性对照，以含体积分数0. 15胎牛血清L

8、拟DMEM完全培 养液为阴性对照，每3 d换液1次，在培养至4、8、12和16 d时分 别进行碱性磷酸酶染色和钙离子沉淀测定。碱性磷酸酶染色：向培养 板中加入双蒸水配制的蔡酚AS拟MX磷酸盐和Fast blueRR溶液,孵育, 显微镜下测定染料沉积情况。钙离子沉淀的测定：用30 g/L的多聚甲 醛固定细胞30 min,双蒸水洗2次，暗处与50 g/L的硝酸银溶液孵 育10 min,双蒸水洗后暴露于强光下1 h,计数染色细胞沉积颗粒的 数目和大小。 2结果 原代培养细胞12 h可见细胞贴壁，3 d后大部分细胞贴壁，第 1次换液后细胞4 h贴壁，细胞呈多角形、菱形，可见集落形成;9 10 d细胞间

9、相互融合达90%。传代后细胞4 h贴壁，生长迅速，细胞 呈较为均一的梭形、多角形，并呈漩涡状排布。rMSC生长曲线呈S 形，第35代增殖迅速,1代和8代次之,10代生长明显减慢（图l）o 分离纯化的细胞不表达造血细胞表而标志CD34,而强表达CD44、CD90, 说明所提取、纯化的细胞是MSC,而不是成纤维细胞或造血干细胞。 诱导组第8天细胞碱性磷酸酶染色可见棕黑色颗粒，第12天棕黑色颗 粒明显增多增大，提示碱性磷酸酶染色阳性，而阴性对照组无此颗粒。 硝酸银染色诱导组呈多量黑色颗粒，而阴性对照组无此颗粒，阳性对 照组颗粒更为粗大。3讨论 近年来研究表明，MSC是一种具有多向分化潜能的干细胞，特

10、定 条件下可向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等分化1拟2。 体内多种影响其分化的可溶性因子己被分离鉴定，如MSC在含有维生 素C、地塞米松、E拟磷酸甘油的培养基中培养时，细胞能够产生碱 性磷酸酶，并具有矿化能力,具备成骨细胞的生物学特性3。 在近年的实验研究中，人们过多地关注成骨基质在MSC分化过程 中的作用，却忽略了细胞外基质结合行为对其分化的影响。有报道证 明，胶原I【在软骨形成过程中表达最高，而胶原I在骨化阶段沉积最 多40在体外实验中，MSC培养于胶原I基质上时会发生成骨分化, 并且需要与胶原I结合整合素Q2P1的相互作用5。细胞外基质蛋 白通过结合细胞表而特异的整合素受体而

11、影响细胞的生物学行为，这 些受体能启动细胞内信号通路，控制基因表达、细胞骨架形成和细胞 形态。显然，作为细胞外基质主要成分的胶原在MSC成骨分化过程中 起了一定的作用。 本实验采用全骨髓培养法，将rMSCs直接加入培养瓶中而未先进 行分离。由于rMSCs贴壁生长，而造血细胞悬浮生长，经3代换液培 养后能基木去除未贴壁细胞3。基于细胞外基质在MSC成骨分化过 程中起一定作用，用构成细胞外基质主要成分的VN研究rMSC与细胞 外基质结合对tMSC成骨分化的影响，并采用碱性磷酸酶染色6、硝 酸银染色证明成骨分化的程度。结果显示，rMSC可与VN正常结合， 并在共同培养第8天出现成骨分化倾向，第12天

12、成骨分化明显，细胞 呈典型成骨细胞表型，碱性磷酸酶活性增高，硝酸银染色显示有大量 钙结节形成，证明rMSC与细胞外基质结合可能参与了成骨分化过程。 rMSC是如何将与细胞外基质结合转化为MSC细胞分化行为，尚需进一 步研究。 【参考文献】 1JKNIPPENBERG M, HELDER M N, DOULABI B Z, et al. Adipose tissue拟derived mesenchymal stem cells acquire bone cell拟like responsiveness to fluid shear stress on osteogenic stimulation

13、 j . Tissue Engin, 2005, 11(11拟12):1780拟1788. 2 JIANG Y, JAHAGIRDAR B N, REINHARDT R L, et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow J . Nature, 2002,418:41 拟49. 3 刘斌饪，李宁毅,樊功为，等.大鼠骨髓间充质干细胞的培 养鉴定及向成骨细胞诱导分化研究J.齐鲁医学杂志， 2007,22(3) : 215拟217. 4 B0RTELL R, BRA0XE L M, TASSINARI M S, et al. Gene expression during endochondral bone development: evidence for coordinate expression of transforming growth factor beta 1 and collagen type I J . J Cell Biochem, 1990,44(2):81拟91. 5JCATELAS I, SESE N, WU B M, et al. Human mese